第4章 沉淀法.ppt

第4章 沉淀法 知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法，金离子沉淀法。 重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。 难点：常用沉淀方法的灵活运用。 一、概述： 在生物医药工业和中药现代化行业，沉淀技术是作为传统的初级分离手段。 目前，沉淀技术广泛应用于实验室和工业规模蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子物质和黄酮、生物碱、皂甙等生物小分子物质的回收、浓缩和纯化。 1.1 定义: 沉淀是指因理化因素的改变引起生化活性物质的溶解度降低，导致固体成相的现象。 1.2 沉淀与结晶的区别: 前者的同类分子或离子以无规则的紊乱排列形式析出，组成成分复杂，其纯度远低于晶体。后者以有规则的排列形式析出。 1.4 沉淀法分类： a.在生产的前期就可使原料液体积很快地减少10-50倍,从而简化生产工艺、降低生产成本。 b.使中间产物保持在一个中性温和的环境。 c.可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中分离出来,避免蛋白质的降解,提高产物稳定性。 d.用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术,可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。 1.4 沉淀法分类： 盐析法 有机溶剂沉淀法 选择性变性沉淀法 等电点沉淀法 离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 高价金属离子沉淀法 二.蛋白质的溶解特性 蛋白质的溶解行为由一个独特的性质，其组成、构象以及周围的环境所决定. 组成蛋白质的各个氨基酸的疏水程度是不相同的,其中苯丙氨酸被认为是最疏水的,而精氨酸则是最亲水的.见表15.1 影响蛋白质溶解度的主要因素(表15.2) 表15.1 影响蛋白质溶解度的主要因素(表15.2) 三.蛋白质胶体溶液的稳定性 3.1蛋白质分子在溶液中的稳定性可用erjaguin-Landau和Verwey-Oveveek(DLVO)理论进行描述,该理论是以胶粒间的范德华力和胶粒与液面存在的电荷斥力平衡为基础的。 3.2静电斥力 在蛋白质颗粒和溶液界面之间存在有三种电位：见图15.3 (1)胶核表面的电位 ф0 ,是整个双电层的电位或称Nerst电位。 (2)Stern平面的电位 ф0 。 (3)在滑动面上的电位 ξ 。 这三种电位中只有 ξ 电位是控制胶粒间电排斥作用的电位.它取决于Nerst电位和反离子的浓度及电荷大小,即随着溶液中离子浓度和价数的升高, ξ 电位下降,从而使颗粒间斥力强度减少,溶液趋于不稳定,蛋白质也就会沉淀下来,见图15.4 图15.3 图15.4 3.3 吸引力 Van der Waals(范德华)力包括下列三种力,即偶极力,诱导力,色散力. 这些范德华力及其产生的位能随着颗粒间距离的增加而减少，见图15.5 颗粒间相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝集 的活化能势垒；在高离子强度时，吸引力超过斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。 图15.5 蛋白质的理化性质的回顾 蛋白质按功能可分为活性蛋白与非活性蛋白，活性蛋白有：酶、激素蛋白、运输和贮存蛋白、运动蛋白、防御蛋白、病毒衣壳蛋白、受体蛋白、毒蛋白和控制生长与分化的蛋白等；非活性蛋白如：胶原蛋白，角蛋白等。 通常，大部分蛋白质可溶于稀盐、稀酸、稀碱和水中，蛋白质在不同溶剂中的溶解度差异主要取决于其自身分子结构性质（如亲疏平衡值各不相同的氨基酸组成等内因）和溶剂的理化性质（如温度、pH值和离子强度等外因）。 因而，可用不同的溶剂或缓冲液提取、分离、纯化蛋白质和酶。 凡质点大小在1-100 nm范围内所构成的分散系统称为胶体。蛋白质分子的直径一般在2-20 nm范围内，且蛋白质分子表面分布着与水分子结合的亲水氨基酸的极性R基。天然蛋白质溶液得以保持稳定的亲水胶体性质，其稳定性取决于：水化作用（水化膜的存在，能防止蛋白质分子相互碰撞而聚集）和电荷的排斥作用（两性解离，同性电荷相互排斥而使蛋白质无法聚集）。 当改变蛋白质的质点大小，电荷情况和水化作用的强弱，将破坏蛋白质的稳定性，蛋白质就从溶液中沉淀出来，这就是蛋白质的沉淀作用。 因此，在生物大分子的分离纯化中，常利用蛋白质的沉淀作用来分离和制备蛋白质和酶。如：采用盐析法从鸡蛋壳中提取溶菌酶和采用乙醇分级沉淀血浆蛋白。 由于蛋白质是两性生物大分子电解质，在水溶液中，蛋白质表面存在不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区。蛋白质和氨基酸一样，既含有酸性的基团又含有碱性的基团，在特定的pH范围内能解离产生带正电荷或带负电荷的基团。对于某一特定蛋白质而言，当在某一pH时，其所带电荷正负相等（即静电荷为0），这一pH值被称为蛋白质的等