第三讲功能基因组学.ppt

第二讲 基因组序列诠释 5. 转录物组 6. 蛋白质组 问题 细胞周期的不同时期 个体发育不同阶段 不同的器官和组织 不同的外界环境下 各种基因的表达与否、量的差异、表达部位如何 5. 转录物组 5.1 Northern杂交 杂交主要步骤： 提取总RNA（不同组织、不同器官） ↓ 变性电泳 ↓ 制备目的基因探针 转移尼龙膜 （放射性 或 化学标记法） 杂 交 ↓ 扫描或放射自显影 ↓ 依据杂交信号的强弱、有无判断基因的表达部位、 表达量、表达时期等 5.2 SAGE SAGE （serials analysis of gene expression） 基因表达系列分析 1995 Velculescu 及其同事年创立 SAGE特点： 进行转录物组研究，也就是转录水平的研究； 通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息； SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息，这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策略； SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速； SAGE 技术的主要理论依据： 来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的标签（tag）； 通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大量多联体（concatemer），对每个克隆到载体的多联体进行测序，并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基因的表达风度（abundance）。 5.3 基因芯片 表达芯片实例 6. 蛋白质组 6.1蛋白质组(Proteome) Proteome来源于 Proteins和 genome 两个词的组合,意思是Proteins expressed by a genome,即基因组表达的蛋白质. 蛋白质组定义 广义上是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质; 狭义上, 可以指不同时期细胞内蛋白质的变化. 蛋白质组学定义 研究蛋白质组结构和功能的领域称为蛋白质组学. 蛋白质组学的研究内容: 分析全部蛋白质组所有成分以及它们的数量; 确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、生物活性和特定功能等 6.2 蛋白质组分析复杂性 蛋白质有许多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等； mRNA 的可变剪接、程序性移码和可控突变，1个基因可编码许多不同的蛋白质，常常表现为组织特异性； 蛋白质之间存在大量的相互作用，如形成同源或异源二聚体、三聚体或多聚体，不同的结合状态有不同的活性； 1种蛋白质可参与多种反应，或多种蛋白质参与1种反应。 6.3蛋白质组研究技术 蛋白质组主要研究技术： 双向电泳 生物质谱技术 蛋白质芯片 酵母双杂交 6.3.1 双向凝胶电泳 样品制备（包括蛋白质的溶解、变性及还原，从而去除非蛋白质杂质等）→ 第一向等电聚焦（根据蛋白质电荷差异进行分离）→ 第二向SDS（以蛋白质分子量差异为基础）→蛋白质的检测（用考马斯亮蓝、银染、铜染等方法）→图谱数字化分析（图象扫描、确定每个蛋白质点的等电点和分子量，寻找差异蛋白） 6.3.2 蛋白质组分析技术