分子生物学实验技术方法.docVIP

【实验技术方法】分子生物学技术(zt)分子生物学技术 ? 真核细胞DNA的制备与定量|质粒DNA的碱裂解法提取与纯化|λ噬菌体DNA提取|DNA分子的限制性内切酶消化|DNA片段回收与纯化|目的基因的亚克隆|PCR|引物参数计算|PCR产物的克隆|DNA序列测定|Southern 杂交|PCR-SSCP|细胞凋亡|RNA操作中的一般要求|RNA的制备|mRNA的分离与纯化|RT-PCR|Northern Blot|RPA|ddPCR|原位杂交|原核表达|蛋白SDS电泳|Western|表达蛋白的分离与纯化|表达蛋白的生物学活性的检测|真核转染? ? ? ? ? ? 真核细胞DNA的制备与定量 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。⑷ 60°C水浴1-3hr。2．培养细胞处理：⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。⑵ 离心4000g×5min，去除上清液。⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。⑷ 50-55°C水浴1-2hr。（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等