第九讲基因操作的工具酶辩析.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 用蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶I后 ①小片段： 5’ 3’ DNA外切酶活性 ②大片段： 5’ 3’ DNA聚合酶活性 3’ 5’ DNA外切酶活性 大片段称为Klenow大片段酶 2.Klenow片段 四. DNA聚合酶 * E.coliDNA聚合酶I和Klenow片段 5’到3‘DNA聚合酶活性 3’到5’ DNA外切酶活性 5’到3’ DNA外切酶活性 5’到3’ DNA外切酶活性 蛋白酶处理 DNA聚合酶I全酶 Klenow片段酶 四. DNA聚合酶 * 用途 Klenow片段广泛用于各种克隆实验 补齐双链DNA的3’末端；如补平经限制酶消化的DNA所形成的3’凹端 双链DNA3’末端的标记；标记DNA片段的末端等 在cDNA合成中，第二链的合成 DNA序列分析 3’-端的末端标记 随机引物标记核酸探针 四. DNA聚合酶 * 3.T4 DNA聚合酶 来源：从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到 具5’ 3’聚合酶活性和3’ 5’外切酶活性 四. DNA聚合酶 * Taq DNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃ 需要Mg2+(10 mmol／L)，在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moI／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40 mmol/L，KCl为60 mmol/L 最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性 自1976年从Thermus aquaticus菌中分离纯化后，直至1985年PCR概念形成，才将此酶应用于PCR技术的建立和完善。对基因克隆、测序、突变研究和检测诊断等方面发挥巨大作用 4.Taq DNA聚合酶 四. DNA聚合酶 * 5.逆转录酶 一种有效的转录RNA成为DNA的酶，即以RNA链为模板，以带3’-OH末端的DNA片段为引物，沿5’ 3’方向合成DNA链 产物DNA又称cDNA，即互补DNA 逆转录酶又称RNA依赖的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase），存在于肿瘤病毒中 主要用途：转录mRNA成为cDNA制备基因片段 四. DNA聚合酶 * 种类： AMV-逆转录酶 Mo-MLV-逆转录酶 5’?3’聚合酶活性（+） 3’ ?5 ’外切酶活性（-） 四. DNA聚合酶 * 催化RNA体外合成反应 依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶 6. RNA聚合酶 四. DNA聚合酶 * 五. DNA和RNA的修饰酶 核酸酶 碱性磷酸酶 磷酸激酶 末端脱氧核苷酸转移酶 甲基化酶 * 以核酸为底物的水解酶 按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切或外切酶（许多兼有内外切活性） 5’-核酸酶或3’-核酸酶 常用：BAL31核酸酶、核酸酶S1 、绿豆核酸酶、RNaseA 、 RNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌体外切核酸酶等 1.核酸酶 五.修饰酶 * 核酸酶 非专一 专一性 内切酶 外切酶 RNA DNA 内切酶 外切酶 外切酶 内切酶 3＇-核酸酶 5＇-核酸酶 非限制性 限制性 3＇-核酸酶 5＇-核酸酶 核酸酶的分类 五.修饰酶 * 1）核酸酶SI 功能： 降解ssDNA或ssRNA形成5’-磷酸末端的单或寡核苷酸片段 应用： 分析DNA：RNA杂交体结构。通过降解成熟mRNA与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位 切除DNA片段上的单链末端，形成平末端 切开cDNA合成过程中形成的发夹环 在限制酶位点上产生小缺失 五.修饰酶 * 核酸外切酶III 核酸外切酶VII DNA酶I RNA酶A (牛胰) RNA酶TI RNA酶H 其他常见核酸酶 五.修饰酶 * 2.碱性磷酸酶 功能：催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’ 端磷酸基团, 从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接 用途： 在用γ-P32磷酸和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA之前，进行碱性磷酸酶处理； 在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接 五.修饰酶 * 细菌碱性磷酸酶（BAP）：E.coli中分离 牛肠道碱性磷酸酶（CIP）牛肠道分离 BAP活性更高, 对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性 除去C