实验六、七 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白专用课件.pptVIP

实验六 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白质 指导教师 刘建昌、池雪林 一、目的 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳的原理、操作方法。 2、学会用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。 二、原理 “不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品分离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（1）使用两种不同浓度的凝胶系统；（2）配制 两种凝胶的缓冲溶液成分及PH值不同；（3）配胶缓冲液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、PH值也不相同。在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是Tris-HCL，PH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶，成胶的缓冲液是Tris-HCL,PH8.9。电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，PH8.3。可见，凝胶浓度、成胶成分、PH值与电泳缓冲液系统各不相同，形成了一个不连续系统。 在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离子流向阳极泳动。当电极缓冲液（pH8.3）中的甘氨酸离子进入浓缩胶时，pH值降到接近于甘氨酸等电点（5.97），于是甘氨酸的解离度突然降低，所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中蛋白质成分也进入浓缩胶，pH值的改变虽对其解离度有影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率比甘氨酸要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会造成阻碍。浓缩胶中的Tris-HCl中Cl离子则全部解离，其迁移率最快。于是在浓