《中国药典》2015年版微生物基本知识.ppt

微生物检查体系的调整 微生物检测环境变化 控制菌项目变化 《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》 通用要求要点： (1) 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。（9201）药品微生物检验替代方法验证指导原则 (2) 环境洁净度应符合要求。定期检测：不低于B级的单向流空气区域、工作台面、环境。参考USP〈1117〉实验室分区原则。 (3) 前处理：供试品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。表面活性剂的无毒性及与相容性。 (4) 方法选择：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。（平皿法、薄膜过滤法和MPN法） (5) 菌种管理：（9203）药品微生物实验室质量管理指导原则关于菌株管理的要求。 (6) 阴性对照：微生物检查需进行阴性对照试验。如果对照有菌生长，应进行偏差调查。 试验菌 微生物计数用培养基 培养基适用性检查 培养基适用性检查 计数方法适用性试验 2、接种和稀释 接种和稀释 消除供试品的抑菌活性的方法 （1）增加稀释剂和培养基的用量； （2）加入中和剂或灭活剂； （3）采用薄膜过滤法和冲洗； （4）综合上述措施。 ●根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检测。 培养条件 结果判断 供试品检查部分 1、操作 供试品检查部分 2、培养 供试品检查部分-结果判断 供试品检查部分-结果判断 供试品检查部分-计数标准 《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》 通用要求要点： (1)控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。（9201）药品微生物检验替代方法验证指导原则。 (2)供试液制备及实验环境要求同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》参考USP〈1117〉实验室分区原则。 (3)前处理：供试品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。表面活性剂的无毒性及与相容性。 (4)在各控制菌项下：生化实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定实验。”改为较少的生化实验或“采用其它适宜方法进一步鉴定。” 控制菌结果判断趋向多样化 ? 控制菌检查中将原来大肠菌群的检测改为耐胆盐的革兰氏阴性菌，另外培养基体系也有较明显的变化，较少的生化实验或采用其它适宜方法进一步鉴定（镜检、生化、色谱光谱技术、分子生物学等） 供试品检查部分-耐胆盐革兰阴性菌 大肠菌群的定义是指在37℃生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或兼性厌氧的无芽孢杆菌。它不是分类学上的名称。符合上述定义的菌除埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。 供试品检查部分-耐胆盐革兰阴性菌 取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（通则1105）制成1:10供试液，混匀，在20~25 ℃培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不繁殖（约2小时）。 取相当于1g或1ml供试品的上述预培养物接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30~35 ℃培养24~48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30~35 ℃培养18~24小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。 1:10TSB供试液（20-25 ℃ 2 h） 肠道增菌肉汤 → 紫红胆盐葡萄糖琼脂 （大肠、铜绿+/金葡-） （大肠、铜绿+＆指示） 24-48h 18-24h 供试品检查部分-耐胆盐革兰阴性菌 选择和分离培养 取相当于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道增菌液体培养基中，30~35℃培养24~48h。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30~35 ℃培养18~24h。 结果判断 若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表二查对1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。 表2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N） -----------------------------------------------------