屠宰工作环境中非结核分枝杆菌流行情况.docVIP

屠宰工作环境中非结核分枝杆菌流行情况 　　摘要：调查屠宰场工作环境中非结核分枝杆菌（NTM）流行情况，为在屠宰场及其他NTM散播环境中工作人员的医疗保健工作提供参考。吉林省白城市内多家牲畜屠宰场内地表污水及宰杀的猪、牛肠系膜淋巴结和颌下淋巴结中分离NTM，用细菌分离培养、菌种鉴别培养、生化鉴定及分子生物学鉴定等方法联合鉴定屠宰场内工作环境中的NTM流行情况。屠宰场工作环境中NTM总分离率为2.73%，其中地表污水中NTM分离率为3.50%，猪、牛肠系膜淋巴结NTM分离率为2.80%，颌下淋巴结NTM分离率为2.00%。所分离的NTM中包括常见的致病力较强的母牛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌等菌型。屠宰场中的工作人员属NTM的易感高危人群，应加强对该类工作人员NTM的保健防治工作，同时也为其他NTM高危易感环境中工作人员的医疗保障提供参考。 　　关键词：屠宰场；非结核分枝杆菌；流行情况调查；分离率 　　中图分类号： S858.23 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.028 　　非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacterium， NTM）在临床上常引发与结核病类似的症状，这给该菌感染后的及时诊治带来了困难[1]。该菌属革兰氏阳性菌，染色后不易被酸和酒精脱色，这种特性可以作为临床上对分枝杆菌的初步诊断。该菌虽然广泛存在于环境中，但是其易感人群主要以老人、婴幼儿及长期处于高危环境中的人群为主。屠宰厂内工作人员可能接触带菌的动物器官，其工作环境可能成为NTM的高危易感区域。所以掌握屠宰场工作环境中NTM的分布流行情况，对生产工作人员健康保障工作是十分必要的，也可以为其他高危易感环境中工作人员的疾病防疫工作提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 标准菌株和待检样品 实验所用标准菌株戈登氏分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌均购于中国科学院微生物研究所。胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌为吉林农业大学微生物教研室保存的国际标准株。 　　待检样品：吉林省白城市生猪屠宰场、九一三屠宰场、大屯屠宰场、鹤翔肉类屠宰加工厂等多个牲畜屠宰厂生产车间采集地表污水及猪、牛的肠系膜淋巴结与颌下淋巴结作为待检样品。 　　1.1.2 分离培养基 采用改良罗杰氏培养基（L-J）进行NTM的分离鉴别与扩增培养。培养基按《病原细菌检验技术》中的方法配制。 　　1.1.3 各种主要试剂 柠檬酸铁铵、亚碲酸钾等生化试剂均购自北京化工厂；酚酞二硫酸三钾购自比利时ACROS化学公司；限制性内切酶、Taq酶等分子生物学试剂购自Takara公司；引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成；其他无机化学试剂均为分析纯试剂，购自北京化学试剂有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细菌分离培养 酸处理法：用十字匀浆器研磨样品，浆液接种于L-J斜面培养基，37℃培养，每3天定期观察，标记生长菌落，抗酸染色做出初步鉴定。8周后仍未生长者或抗酸染色阴性者视为阴性。 　　1.2.2 细菌鉴定 　　生物学与生物化学方法鉴定。 　　生长特性实验：分离菌接种于L-J培养基上，分别在28℃、37℃、45℃条件下培养，定期观察记录生长情况。 　　菌体产色实验：避光与不避光条件下观察分离菌产色培养结果。 　　培养基生长实验：观察分离菌于PNB培养基、TCH培养基、5%NaCl培养基、苦味酸培养基、谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基上生长情况。 　　生化实验：分别进行耐热触酶、硝酸盐还原、吐温-80水解、尿素酶、芳香硫酸酯酶、铁离子吸收、亚碲酸盐还原等实验检测分离菌生化特性。 　　1.2.3分子生物学方法鉴定 采用聚合酶链式反应―限制性片段长度多态性分析方法（PCR-RLFP）对分离菌株进行检测。合成通用引物Tb11：ACCAACGATGGTGTGTCCAT和Tb12：CTTGTCGAACCGCATACCCT扩增NTM的保守序列hsp65片段，反应条件：94℃ 5分钟预变性，94℃ 1分钟变性，60℃ 1分钟退火，72℃ 1分钟延伸，共30个循环后72℃ 10分钟延伸，扩增得到439bp的目的片段。将扩增产物用限制性内切酶BstEII和HaeIII进行酶切，2%琼脂糖凝胶电泳检测，分析各分枝杆菌特征性的酶切图谱， 鉴别分枝杆菌类型。 　　2 结果 　　2.1 细菌分离培养结果 　　实验共计检测样品1500份，其中屠宰场生产车间地表污水共计500份，肠系膜淋巴结500份（牛肠系膜淋巴结250份、猪肠系膜淋巴结250份），颌下淋巴结500份（牛颌下淋巴结250份、猪颌下淋巴结250份）。抗酸染色阳性样