【2017年整理】硫化叶菌的假定蛋白质基因的PCR扩增.docVIP

硫化叶菌的假定蛋白质基因的PCR扩增 生122-1 刘昌陇 201270502101 【前言】 聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction） ，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术关键在于引物的设计，其目的就是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 引物的设计需要注意： ①引物长度在18-35bp，G+C含量在40%-60%之间，内部无发卡结构； ②引物之间避免形成二聚体； ③引物3’端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配； ④在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片段，有时需要在引物的3’端加上适当的酶切位点。 【目的】 从NCBI中获得Sulfolobus solfataricus (12389bp)硫化叶菌的16SrRNA的序列，其中80—709片段是编码保留待定蛋白的位置，使用软件Vector NTI Suite找出适宜的酶切位点，用特定的限制性酶切下，并电泳分离出该片段，选出合适的引物，实现PCR的扩增以及对该蛋白的分析。 【材料】 种类 名称 界 门 纲 目 科 属 sulfolobus 硫化叶菌 古细菌 泉古菌门 热变形菌纲 硫化叶菌目 硫化叶菌科 硫化叶菌属 【工具】 Vector NTI Suite是综合性蛋白核酸分析工具，具有蛋白核酸序列分析、引物设计分析、序列显示等多种功能，本次报告利用其做引物的设计分析。 【方案设计】 （1）目的片段的酶切：使用软件Vector NTI Suite找出适宜的酶切位点，用特定的限制性酶切下； （2）电泳分析：将获得的各酶切片段进行电泳，分析选择何种酶以能获得适宜长度以及包含目的片段的酶）； （3）按照要求找出合适的引物。 【分析】 找出合适的酶切位点： 将硫化叶菌的序列导入Vector NTI Suite中，本次所需目的基因为序列的80-790片段，通过软件找到合适的酶切位点，添加所有酶后所形成的酶切位点图如下： 我们需要的片段长度为80-709bp,由上图可知当用BrfBI酶切时，得到的片段长为719，这样所得到的引物片段过短，显然不合适，因此考虑到所选的酶切位点最好能够形成粘性末端，可得适宜的酶有AsuHPI(1-791)、BstAPI(1-889)、BstIZ316（1-980）等。 电泳分离酶切产物 选取能够使目的基因片段从所有的酶切产物中分离出来的酶，那么酶切产物中不能存在和目的基因片段长度相近的片段。 选择BstAPI酶，选择琼脂糖凝胶电泳2h，能找到较好的片段，在1-889之间，结果如下： 选择AsuHPI酶，选择琼脂糖凝胶电泳4.7h，能找到较好的片段，在1-791之间，结果如下： 根据酶切产物设计引物 按照下图的要求设计引物： PCR Analysis #1: Product of length 727 (rating: 144) Contains region of the molecule from 80 to 806 Tm: 70.9 C TaOpt: 39.8 C GC: 29.2 Sense Primer: GTGAGAAAACAACT Similarity: 100.0% Length: 14 Tm: 19.8 C GC: 35.7 dH: -94.3 kcal/mol dS: -253.1 cal/mol dG: -17.1 kcal/mol Antisense Primer: GTTCGGTGATTA Similarity: 100.0% Length: 12 Tm: 16.7 C GC: 41.7 dH: -85.7 kcal/mol dS: -228.5 cal/mol dG: -15.8 kcal/mol Tm Difference: 3.1 GC Difference: 6.0 #2: Product of length 727 (rating: 135) Contains region of the molecule from 80 to 806 Tm: 70.9 C TaOpt: 39.8 C GC: 29.2 Sense Primer: GTGAGAAAACAACTC Similarity: 100.0% Length: 15 Tm: 24.1 C GC: 40.0 dH: -