实验五 细胞染色体数目分析.pptVIP

实验五 细胞染色体分析(秋水仙素裂解法) 一、原理 二、实验材料 三、操作方法 * * 细胞处于分裂中期时染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体最好时期。 秋水仙素能破坏细胞纺锤体,并阻止其形成,使分裂的细胞停留在分裂中期。 秋水仙素使染色体收缩，形成清晰的轮廓。 低渗液处理可使细胞肿胀，染色体分散 空气干燥使细胞和染色体展平。 1、有丝分裂抑制剂 100×浓缩的秋水仙素（20μg/ml）：将0.1mg秋水仙素溶于5ml重蒸水中，分装后冰冻保存。 2、细胞消化液：0.25%胰蛋白酶溶液 3、低渗溶液：0.075mol/L KCl 4、固定液：甲醇∶冰乙酸（3∶1混合） 5、染液(Giemsa 吉姆萨染液) 姬姆萨染色液原液：姬姆萨染料0.6g加于50mL甘油中，置55℃～60℃水浴1.5h～2h后，加甲醇50mL，静置24h以上，过滤即成姬姆萨染色液原液，装于棕色瓶内保存备用。 10% Giemsa染液：取原液1份加入9份 0.01mol/L pH7.2 PBS中混匀。 6、细胞：Marc-145细胞 7、载玻片：4℃预冷 秋水仙素处理，使细胞停止分裂 收集处理的细胞 取对数生长期的Marc-145细胞一瓶，加入秋水仙素到培养液内使终浓度为0.4μg/ml。 37℃温箱中继续培养2.5-3h。 倾出秋水仙素处理液，用0.25%胰酶溶液消化细胞，细胞消化好后加入DMEM培养液将细胞吹下。 1600r/min离心5min收集细胞。 低渗处理，使细胞肿胀 将细胞沉淀用600μl 37℃预温的0.075mol/L 的KCl低渗溶液悬浮，混匀后置37℃温育30-35min。 加入新配制的固定液（甲醇∶冰乙酸） 600μl，混匀，1600r/min离心5min，弃上清液。 再加入固定液800μl，轻轻混匀，静置20-30min，1600r/min离心5min，弃上清液。 再次加入固定液800μl，轻轻混匀，静置20-30min或4℃过夜，1600r/min离心5min，弃上清液。 固定 细胞重悬与浓度检测 每管加入100μl固定液，混匀。 吸取50μl细胞悬液于4℃预冷的干净载玻片上，轻吹液滴，使细胞悬液铺展于玻片上，室温下自然干燥。（在显微镜下观察，如果细胞均匀地铺开，细胞不重叠，则用同样细胞浓度制备细胞样品。否则要进一步稀释细胞悬液，以达到满意的铺片效果。） 染色 C D 用10% Giemsa染液染10-15min。流水冲洗，自然干燥。 观察与计数 将载玻片置显微镜油镜下观察计数。