食管癌组织微卫星DNA序列不稳定性和杂合性缺失及预后的研究.docVIP

食管癌组织微卫星DNA序列不稳定性和杂合性缺失及预后的研究 　　作者：翟瑜 李勇 苏力 范立侨 高立平 郭贵军 脱红芳 王春城 暴雷 作者单位：河北医科大学第四医院外三科，河北 石家庄 050021 　　【摘要】 目的 探讨微卫星DNA序列不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)与人食管癌发生、临床病理特征及预后的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对30例人食管癌中MSI及LOH阳性情况进行研究，术后随访5年，了解预后。 结果 D3S1067位点MSI发生检出频率较高，为26.7%;D18S58位点 MSI阳性率为20%。MSI的发生在食管小细胞癌中较食管鳞癌为高(P0.05);MSI、LOH与肿瘤的病理分级、PTNM分期、有无区域淋巴结转移和浸润深度无关(P0.05)。 结论 食管癌在3p和18q染色体位点均存在微卫星不稳定现象;D3S1067和D18S58二个位点上MSI与食管癌的临床病理类型均相关;研究未发现这两个位点MSI、LOH与食管癌的临床分期、细胞分化程度、癌组织浸润深度和有无区域淋巴结转移等参数相关;3p位点基因的改变在食管鳞癌发生过程中具有较重要意义。 　　【关键词】 食管癌;微卫星不稳定性;杂合性缺失;聚合酶链反应;肿瘤 　　食管癌的发生、发展过程中涉及一系列遗传学的改变，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。近期研究发现，微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)在肿瘤的发生过程中能间接反映基因突变情况，可作为基因突变检测的筛查方法〔1〕。联合检测食管癌组织MSI和LOH，寻找其与肿瘤发生之间的关系，国内尚未见报道。本文拟研究MSI、LOH与人类食管癌生物学行为和病理类型之间的关系及其与食管癌患者预后的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 研究对象 我所采用标本均取自2001年8月～2002年8月在我院胸外科行食管癌手术切除的病例，共30例，其中男17例，女13例;年龄42～72(平均62.2)岁。每1病例取肿瘤中心部位的癌组织及远离癌组织5 cm以上的食管正常黏膜，离体标本手术切除后立即置于液氮中，然后转移至-80℃低温冰箱中保存。 　　1.2 引物设计 选取3号染色体短臂上D3S1067和18号染色体长臂上D18S58两个基因位点，其引物设计参考基因文库，由上海生工生物工程公司合成。D3S1067 3p21.1～3p14.3引物1：5′TCATCTATCTCCCAACTGTTGAG3′，引物2：5′GAGCACTACCTGTTTAAGATAGG3′，95 bp。D18S58 18q22.3～18q23引物1：5′GCTCCCGGCTGGTTTT3′，引物2：5′GCAGGAAATCGCAGGAACTT3′，144～160 bp。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 标本基因组DNA的提取 酚-氯仿异戊醇法提取基因组DNA，溶于TE缓冲液，-20℃保存。 　　1.3.2 DNA的浓度测定及纯度判定 取1.5 Μl DNA溶液，用无菌蒸馏水稀释1 000倍，以蒸馏水做空白对照，在紫外分光光度计上读取A280和A260的光密度值，按下列公式计算浓度：DNA浓度Μg/ml=(A260×50×稀释倍数)/1 000;DNA纯度的测定：A280/A260比值介于1.7～2.0。 　　1.3.3 MSI位点引物的PCR扩增 PCR反应体系(体积25 Μl)：10×反应缓冲液(Mg2+Free) 2.5 Μl;MgCl2 1.0 mmol/L(扩增D3S1067) 或 0.8 mmol/L(扩增D18S58);4种dNTP 混合物(美国Promega公司)各100 Μmol/L;模板DNA(上海生工生物工程公司)1.0 Μg(扩增D3S1067)或0.1 Μg(扩增D18S58);上下游引物(上海生工生物工程公司)5 pmol/L 1.0 Μl(扩增D3S1067)或12.5 pmol/L 0.5 Μl(扩增D18S58);TaqDNA聚合酶(华美生物工程公司)1.5 U(扩增D3S1067)或0.9 U(扩增D18S58);三蒸H2O补至25 Μl。将反应管置于PCR扩增仪中，按下列条件进行扩增：D3S1067：①预变性94℃，3 min;②变性：94℃，30 s;退火：59℃，30 s;延伸：72℃，30 s;40循环;③72℃延伸5 min。D18S58：①预变性94℃，5 min;②变性：94℃，45 s;退火：59℃，30 s;延伸：72℃，45 s;35循环;③72℃延伸10 min