引物的设计.pptxVIP

引物设计 PCR原理、成份 成份要求： 工作环境：PCR bufer（Mg2+） 导向者：引物 DNA原料：4种脱氧核糖核酸 合成机器：酶 温度要求： 94℃：DNA双链打开 54 ℃：引物寻找正确位置 72℃：酶全速加工？ PCR的通俗理解： 扩增出大量的、正确的DNA目标片段！ 背景知识 PCR成分最终的结局： 引物：是PCR扩增产物开端部分，被消耗完 dNTPs：是PCR扩增产物后续部分，被消耗完 10*PCR（Mg2+）：缓冲能力降低或失效 Taq酶：反复高温循环，催化能力降低或失效 PCR是一个复杂、竞争、动态的过程 引物+正确的模板位置 引物+错误的模板位置（错配） 引物自身的发夹（hairpin）结构 引物自身的二聚体（dimer）结构 上、下游引物之间的相互作用 好的引物设计，就是保1的绝对优势，减少2-5干扰 竞争： 引物 dNTPs Taq酶 设计思路 设计准则： 引物Tm值比退火温度高3-5℃ 重要性：3’ 5’ 避免在3’出现G/C 依据GC%，确定退火温度： 40-60%，适中，55℃-60℃； 60%，高GC%，58-62℃ 设计工具 Tm utility：计算GC%和Tm值 Primer Primer5.0寻找合适的引物位置 Oligo 6.0评价引物 Tm utility使用 打开软件，调节Mg2+=2.0时，直接粘贴序列 Primer Premier 5.0使用 打开软件，file→new → DNA sequence 序列框内粘帖，出现对话框，选择as is，OK 原 反向 互补 反向互补 点击Primer → 出现新对话框，点击search 上游引物 下游引物 目的片段 设置完成 → 点击OK ，出现新对话框 点击OK → 出现新对话框search result ΔG值为负值，说明热稳定性高，结合紧密 ΔG值最好 -10 Oligo 6.0使用 打开软件，file→new sequence ，对话框内粘帖序列 工具条accepted →出现多个对话框，关注 melt temperature对话框 进度条 上游 下游 长度 标尺 框选合适序列 改变选框 的长度 查看发夹、二聚体和错配 完全匹配时，above the threshold 错配严重时，above the threshold 错配打分最好控制在100 分类 分类 名称 功能、特殊要求 核酸 类型 DNA（HBV、结核杆菌） 检测有或者无 RNA(mRNA、microRNA等) 检测表达量多少；跨内含子 序列 保守？ 高等（哺乳动物、鱼） 序列保守，针对单个序列 低等（细菌、病毒） 序列不保守，针对群体序列 用途 测序 测序有效长度、位点信息 克隆 添加酶切序列 定量 片段200bp，越短越好 高GC 避免二级结构处设计引物 1. 性别鉴别——人的SRY基因 检测类型：DNA 高等生物：单一序列 2. 沙门菌检测 检测类型：DNA 低等生物：群体序列（先比对序列找保守区） 举例 举例 3. 硒对大鼠睾丸SelV的表达影响：对照组/硒饲养组 检测类型：mRNA 高等生物：单一序列 背景知识：1. DNA量多，结构稳定 2. mRNA量少，易降解 3. 引物设计要尽量跨内含子，消除DNA影响 4. mRNA从3’开始反转录为cDNA， 对1000bp 的mRNA的5’反转效率差 跨内含子方法——1 DNA mRNA 两条引物至少有一条引物跨内含子 跨内含子方法——2 DNA mRNA 引物不跨内含子，但中间的内含子序列1000bp 扩增程序72℃ 15S ： 足够扩增200bp的产物， 但不能扩增出1000bp的产物，消除干扰 举例 DBP的rs7041和 rs4588的多态性测序 5’ 3’ 上游测：5’ 下游测：3’ ATGCATG ATGC ATG AT A 添加带荧光的ddNTPs，电泳 测序背景知识 1. 测序有效长度700bp，且约前100bp没有信号或信号差 2. 测位点，位点放中间 3. 特异性的基因引物需要提供， 通用的引物（测质粒）不需要提供 4 测700bp全长，需要上、下游测，拼接 测700bp全长，除上、下游测外，中间需要添加引物 举例 5.大鼠SelV的克隆 前提：克隆mRN