7DNA文库的构建和目的基因的筛选范例.ppt

第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选 Construction of DNA Library and Screening of Target Gene 定义和分类 基因文库指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。 按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为：基因组DNA文库（genomic DNA library）和cDNA文库（complementary DNA library）。 基因组文库：分离特定的基因、分析特定基因的结构、研究基因的起源与进化、基因的表达调控 cDNA文库：大规模基因测序、发现和寻找新基因、基因注释、基因表达谱分析、基因功能研究 DNA文库构建的基本程序 1、提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA ； 2、DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA； 3、重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 目标基因筛选方法 表型筛选法 杂交筛选和 PCR 筛选 免疫筛选法 酵母双杂交系统筛选 第一节 ?基因组 DNA 文库的构建 定义：指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 文库的代表性和随机性 代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。 引用两个策略： 一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等； 二是提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。文库的总容量由外源片段的平均长度和重组克隆的数量共同决定。 为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f） N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数?p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率?f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值 哺乳动物：3*109bp 若p=99%，平均克隆片段长度20kb f=20kb/3*107kb N=690773.2 E.Coli：4639221kb p=99%，f=20kb/4600kb N=1056.9 p=99%，f=10kb/4600kb N=2116 载体的选择 构建大片段基因组DNA文库使用的载体主要有λ噬菌体（λphage）、粘粒载体（cosmid）、细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes, BAC）、酵母人工染色体 YAC（Yeast Artificial Chromosomes, YACs）、 P1 （Bacteriophage P1）和 PAC 。 根据特征，这些载体可以分为两类: 一类是基于噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点； 另一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过 100kb 以上的外源片段。 基因组DNA文库的构建流程 基因组DNA文库的构建程序包含5个部分： ① 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组DNA（High Molecular Weight DNA, HMW DNA）的提取； ③ HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。 1、基因组DNA文库的载体制备 载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。 2、高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。 3、文库的连接转化或包装侵染??? 一般在构建大片段基因组 DNA 文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。 在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。 4、文库的质量检测??? 文库的质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和