第二章--细胞生物学研究方法讲解.ppt

（七）当代显微镜的发展趋势 采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。 自动化与电子化。 二、电子显微镜技术 （一）扫描电镜技术 1.工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大显示出与电子束同步的扫描图像。 2.应用：观察样品标本的表面结构。图像为立体，反映了标本表面的真实结构。（与透射电镜比较） Scanning electron microscope（ SEM） SEM LIGHT PATHWAY Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog（牛蛙内耳毛发细胞） (A). For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C). Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish. （二）透射电镜技术 透射电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样。用于观察样品内部亚显微结构或超微结构。 高压电子枪 高速电子束 电磁透镜 样品 电子束发生投射 荧光屏 （电能转变成光能） 浓淡不同的图像 电镜与光镜的比较 显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 LM TEM 200nm 100nm 0.1nm 可见光 紫外光 电子束 玻璃透镜 玻璃透镜 电磁透镜 不要求真空 不要求真空 要求真空 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 2.光镜与电镜的主要区别 光源不同：光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束 透镜不同 ：光镜为玻璃；电镜为电磁透镜 真空：电子束运动轨迹不受空气干扰；空气对样品的污染；灯丝 的氧化损伤。 显示记录系统 第二节 细胞组分的分析方法 一、离心分离技术 差速离心技术 密度梯度离心技术 二、细胞化学技术 酶化学技术 免疫细胞化学技术 放射自显影技术 三、定量细胞化学分析技术 显微分光光度测定技术 流式细胞术 一、离心技术 分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。 沉降系数：当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离心场强度的沉降速度。 （一）差速离心 Differential centrifugation 1.原理：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 2.特点 介质密度均一 速度由低向高，逐级离心。 3.沉降顺序 核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 4.可将相差悬殊的细胞和细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 The preparative ultracentrifuge（超速离心机）. * * * * * * * * * * * * * * * * 第二章 细胞生物学研究方法 METHODS AND TECHNIQUES 第一节 细胞学形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 普通光学显微镜 相差显微镜 微分干涉显微镜 暗视野显微镜 荧光显微镜 激光扫描共聚焦显微镜 二、电子显微镜技术 透射电镜技术 扫描电镜技术 三、扫描隧道显微镜技术 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像， 经目镜放大成虚像。 一、光学显微镜技术 3.分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。(肉眼、光学显微镜、电子显微镜的分辨率分别为0.2mm、0.2μm和0.2nm ) 光学显微镜的分辨力 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长； N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2， n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 光学显微镜理论放大倍数可以达到1500倍，但由于受到可见光光源衍射效应的限制，其有效放大倍数只能达到1000倍。 1. 用于观察活体细胞； 2. 特殊之处： 环形光阑：位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光