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HRP的色原底物系统 与HRP反应后的颜色 加终止液后的颜色 读数波长 特 点 OPD 临苯二胺 492nm 致畸, 但本底好 TMB 四甲基联苯胺 450nm 操作方便, 本底较高 ELISA 数据的处理 根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程 将所测定样品的OD值代入方程计算出相应的样品的浓度 Protocal 包被:用Coating buffer 1:1000稀释Capture Ab ,100ul/孔,湿盒4℃过夜; 洗板:弃去孔内液体,PBST洗涤,3×3min,控干; 封闭:加1×Assay diluent 200ul/孔,37℃避光孵育2h; 洗板:弃去孔内液体,PBST洗涤,4×3min,控干; 5. 加样:100ul/孔,37℃避光孵育1h ; 6. 洗板:弃去孔内液体,PBST洗涤,4×3min,控干; 7. Biotin-Detection Ab: 用1×Assay diluent 1:1000 稀释detection Ab ,100ul/孔, 37℃避光孵育1h; 8. 洗板:弃去孔内液体,PBST洗涤,4×3min,控干; 9. Avidin-HRP: 用1×Assay diluent 1:250稀释AV-HRP ,100ul/孔, 37℃避光孵育45min; 10. 洗板:弃去孔内液体,PBST洗涤,5×3min,控干; 11. 显色:1×TMB solution,100ul/孔,37℃孵育1-30min; 12. 终止反应:显色完全后加 2M H2SO4 50ul/孔,终止显色反应; 于450nm处读取光密度OD值或吸光度A值; 13. 绘制标准曲线,分析数据 2.洗涤 次日,弃去孔内液体,用0.05%PBST洗板3次(将PBST加入每孔,静置3min 后倾去),控干,洗去游离抗体。 湿盒中,4℃过夜 酶标板 1.包被 (Note PBST洗涤液:0.05% Tween-20 -PH 7.4 1×PBS) 1×Coating buffer 1:1000稀释Capture Ab , 100μl/孔加入到酶标板中,封口膜(或保鲜膜等)封闭酶标板后,放入湿盒中,4℃过夜。 1×Assay diluent, 200μl/孔加入到酶标板中,封口膜封闭酶标板后,放入湿盒中,37℃避光孵育2h。 4.洗涤 弃去孔内液体,用0.05%PBST洗板4次,(将PBST加入每孔,静置3min 后倾去);控干; 37℃避光孵育2h 3.封闭 (Note 1×Assay diluent:用纯水将5×Assay diluent 稀释至1×) 以上助教老师负责完成 5. 加样----抗原与抗体孵育 1)制作标准曲线: 1×Assay diluent 倍比稀释standard,每个梯度各取100μl加入酶标板,做复孔; 2)待测样品:取100μl待测样品加入酶标板,做复孔; 3)空白对照:取100μl 1×Assay diluent加入酶标板,做复孔; 37℃避光孵育1h 50ul Standard 原液 ? ? 1/8 1/16 1/32 待测抗原 100μl 空白对照 阳性对照 每组4位同学的加样顺序: 待测抗原 100μl 待测抗原 100μl 样本有4种,每人选一种做复孔 每组做阳参2个孔 每组做空白对照2个孔(加样1×Assay buffer) 每孔加样100μl 待测抗原 100μl 6. 洗板:弃去孔内液体,PBST洗涤,4×3min,控干; 7.Biotin-Detection Ab: 用1×Assay diluent 1:1000稀释detection Ab ,100μl/孔,37℃避光孵育1h; 8. 洗板:弃去孔内液体,PBST洗涤,4×3min,控干; 9. Avidin-HRP(HRP见光分解,之后所有步骤避光操作) 用1×Assay diluent 1:250稀释AV-HRP ,100μl/孔, 37℃避光孵育45min; 10. 洗板:弃去孔内液体,PBST洗涤,5×3min,控干; 11. 显色: 1×TMB solution,100μl/孔,37℃孵育1-30min; 12. 终止反应: 显色完全后加 2M H2SO4 50μl/孔,终止显色反应;450nm处读取光密度0D值(或者吸光度A值) 13. 绘制标准曲线,分析数据 结果判断 定性实验 显色反应后,如液体颜色变成蓝色则为阳性;仍为无色液体,则待测样品为阴性 定量
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