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第九章 植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立 第一节 植物细胞培养物超低温保存的概念与作用 植物细胞全能性的发现和证实为植物的种质保存开辟了新的途径。随着植物细胞工程技术的长足发展，植物细胞培养物超低温保存及种质库的建立日益引起人们的重视，并已取得明显进展。 一、植物细胞培养物超低温保存的概念 种质资源低温保存的英文名称是cryopreservation，从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。一般而言，人们将－80℃以下的低温称为超低温，干冰温度即－70℃称为极低温，低温则从4℃往下推（李广武等，1998）。对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。目前，冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存是常用的植物细胞培养物超低温保存方法。 二、植物细胞培养物超低温保存的作用 1. 保持细胞培养物的遗传稳定性 在细胞培养物的不断继代培养过程中，染色体和基因会发生改变，从而引起基因型的改变，如产生多倍体、非整倍体及染色体消失和染色体易位等。这些变化导致培养细胞全能性的丧失，即失去形态发生的潜能，或一些具有特殊产物的细胞系和具有某种抗逆性的细胞系有可能在继代培养中丢失重要的性状。已有的研究表明，细胞培养物在液氮超低温保存中不仅能长期保持形态发生的潜能，而且还能保持遗传性状的稳定性，为细胞克隆遗传稳定性的保持提供了一种理想的方法。 2. 植物种质资源的长期保存 农业的未来取决于人类对植物种质资源的占有和利用程度，但由于农业土地的急剧开发，天然植物种质资源日益遭到严重破坏，尤其是那些稀有、珍贵和濒危植物资源。因此，建立长期保存植物种质资源库势在必行。由于细胞培养物能在超低温保存后再生完整的新植株，为植物种质资源的长期保存提供了一条可行而又理想的途径。体细胞种质库的建立是植物种质资源保存的一个重要方面，因为体细胞能够在人工试管条件下大量迅速繁殖，可以节省种子保存过程中资金的耗费。 3. 农作物优良品种及亲本材料种质的长期保存 种子低温保存是防止良种衰变的一条重要途径，但需要大规模基本建设，且耗资较多。体细胞培养物超低温保存，体积小，无需大规模基本建设，耗资少，且在低温保存后能迅速大量繁殖。因此，超低温保存体细胞培养物是农作物优良品种及亲本种质长期保存比较经济的途径。 植物材料超低温冻存的细胞学基础 植物细胞中水分约占细胞总重量的60～90％，而游离水又约占细胞水分的90％，易于冻结。理论上讲，一般细胞外水的冻结温度为－5～－15 ℃，细胞内游离水的冻结在－25℃。在－30 ℃时细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，在－100℃温度下结合水并不冻结。根据Luyet的冻结理论（Luyet 1937），认为细胞游离水的冻结温度－30℃是细胞冻存的安全温度，作为细胞冻存两步冻结法的基础温度。 细胞超低温保存有三个重要操作步骤：一是细胞预冻；二是细胞在－196℃下长期贮存；三是细胞解冻。 植物细胞超低温冻存的设备与方法 一、主要仪器设备 ① 用于组织培养的全套设备； ② 普通电冰箱； ③ －60(C～－80(C的低温冰箱； ④ 程序降温器； ⑤ 装材料的玻璃或塑料试管（5 mL或10 mL，要求封盖严密，不进液氮）； ⑥ 液氮罐； ⑦ 光学显微镜和紫外荧光显微镜，后者用于活细胞荧光染色观察； ⑧ 分光光度计。 二、基本程序 ① 选择生理年龄和生长状态合适的材料用于超低温保存。 ② 预培养。目的是提高细胞抗寒能力，培养时间为3～4周。包括加速传代、提高培养基渗透压和低温锻炼三个过程。第一，加速传代以提高分裂细胞的比例。细胞分裂时体积小，细胞内自由水含量下降，细胞的抗寒力相对提高。第二，用甘露醇和糖等提高培养基渗透压，从而提高培养组织和细胞的渗透压以增强抗寒能力。第三，加入脯氨酸或二甲基亚砜（DMSO）进行短期预冷处理20～60 min，然后逐渐降低温度，直至接近0(C，进行低温锻炼。 ③ 冷处理。第一，保存材料的温度必须降至0(C。第二，加入0(C预冷的冷冻防护剂（甘油、甘露醇、脯氨酸、糖类、二甲基亚砜等），放置30～45 min。 ④ 慢速降温至－30(C～－40(C，停留1～3 h。 ⑤ 投入液氮中－196(C保存。 ⑥ 保存后化冻：37(C～40(C水浴快速化冻。 ⑦ TTC法（氯化三苯四氮唑还原法）检测细胞活力。 ⑧ 再培养与遗传稳定性分析，即观察细胞恢复生长速度、生长量、存活率和植株再生，并进行遗传稳定性分析。 第四节 植物细胞超低温保存的影响因素 1. 植物材料的选择 研究表明，植物基因型、抗冻性、器官组织和细胞的年龄以及生理状态等对超低温保存的效果影响很大；材料的种类和生理状态与冰冻保护剂、降温冰冻和化冻速度有密切关系，一种冰冻保护剂对某种材料有很好的保护效果，而对另一种材