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关于大鼠羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达 　　羊膜位于胎盘绒毛膜内侧，是一层无血管、神经、淋巴和肌肉的透明薄膜，可起到对胎儿的保护作用，与发育中的胎儿联系紧密。人源羊膜细胞在受精后第8 天开始形成，具有多项分化的潜能，可向三个胚层细胞进行分化，近年来研究表明，羊膜上皮细胞能够分化为成熟的神经细胞，并合成释放多巴胺、乙酰胆碱、去甲肾上腺素等神经递质。人羊膜细胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制力，细胞移植后不会发生急性排斥反应。本实验从大鼠羊膜分离获取羊膜细胞，建立稳定培养的条件，并对其生物学特性进行了探讨，为其将来在细胞移植治疗方面的应用提供实验依据。 　　1 材料和方法: 　　1. 1 材料 　　1. 1. 1 主要仪器:CO2培养箱、净化工作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪。 　　1. 1. 2 主要试剂:DMEM 高糖培养基( Dulbeccosmodified Eagle’s medium，DMEM)、人表皮生长因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 缓冲液购自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 购自与 Abcam 公司。CD29、CD44 购自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 购自于 BD 公司。 　　1. 1. 3 实验动物:SPF 级孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，购自中国军科院实验动物中心，许可证号:[SCXK-(军)2014-0004]，实验动物使用批准号:ILAS-PL-2014-001。在无菌条件下进行实验操作分离羊膜组织。 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 羊膜细胞分离及培养:SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥钠(0. 01 mL /g)，麻醉后，无菌条件下开腹，机械性分离子宫层，剥离胎盘，分离羊膜组织置于含有500 U/mL 双抗的 PBS 溶液中冲洗。将羊膜组织放置在含有500 U/mL 双抗的 DMEM 基础培养基中，无菌眼科剪将其剪至1 mm3左右的小块。将组织悬液移至50 mL 离心管中，1 000 r/min 离心 5min，弃上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2条件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培养基终止消化。200 目不锈钢滤网过滤单细胞悬液，接种至 25 cm2培养瓶，含10% FBS、10 mu;g/LEGF 和 500 U/mL 双抗的DMEM 完全培养基培养，隔天细胞换液，2 ～ 3 d 后细胞长满培养瓶85% ～90%时，进行细胞传代。 　　1. 2. 2 流式细胞术检测:取培养 2 ～ 4 代细胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培养基终止消化。细胞计数将其稀释成1 times; 106个，每个流式管1 mL 细胞悬液。每流式管加2 mL PBS 使细胞混匀，2 000 r/min 离心5 min，弃上清液。重复加2 mL PBS 重悬细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清液。每管加 50 mu;L PBS 重悬细胞，加 抗 体 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室温孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重悬细胞2000 r/min 离心5 min，弃上清液。各管加300 mu;L PBS 重悬细胞上机检测。 　　1. 2. 3 免疫荧光细胞染色:取 2 ～ 4 代细胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的 DMEM 完全培养基终止消化。加入完全培养基重悬，至24 孔板中培养。待细胞增殖至 70% 作用时，PBS 冲洗，4% 多聚甲醛(预冷)固定 10 min。PBS 冲洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 times;孵育10 min。PBS 冲洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 mu;L 室温下封闭30 min。吸去山羊血清工作液，抗体稀释液稀释抗体 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100mu;L，4℃过夜孵育。PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。避光条件下，PBS 稀释 FI