重组人转化生长因子β1在CHOdhfr-细胞中的稳定表达和纯化.docVIP

重组人转化生长因子β1在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达和纯化 刘春凤1，张宁2，周婷2，王世媛2，陈清西*1 (1.厦门大学 生命科学学院，福建 厦门361005； 2.厦门特宝生物工程股份有限公司，福建 厦门361022) 摘要：构建含重组人转化生长因子β1基因的真核表达载体，并利用阳离子脂质体介导方法，将构建的表达载体转染到二氢叶酸还原酶缺陷型哺乳动物细胞CHO/dhfr-中，通过MTX加压筛选获得稳定表达重组人转化生长因子β1的细胞株．于14 L细胞发酵罐进行扩大培养，通过ELISA检测其表达量，表达量在3 mg/L左右．采用亲和层析、反相层析及分子筛凝胶层析的方法分离纯化，通过本纯化工艺获得的rhTGF-β1试制品的纯度大于97%，得率在25%以上．通过MALDI-TOF MS质谱测定rhTGF-β1的分子量为25470 D，与理论分子量一致．N端蛋白序列分析仪分析其N端氨基酸序列，测序结果与理论的氨基酸序列一致．重组人转化生长因子β1具有抑制水貂肺上皮细胞Mv-1-Lu增殖的活性，测定rhTGF-β1的活性为3.2×107 IU/mg，比活与RD rhTGF-β1标准品相当．为进一步规模化制备生长重组人转化生长因子β1鉴定基础． 关键词：重组人转化生长因子β1；表达；纯化 Q 356．1 A 收稿日期：2015-01-09 基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划），课题编号2007AA021604 *通信作者：chenqx@xmu.edu.cn 转化生长因子β（Transforming growth factors-β）是一类具有多种生物学活性的细胞因子，参与调节细胞的增殖、分化、发育和凋亡等多种生命活动[]．TGF-β亚家族目前报道有6种，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5和TGF-β6，它们氨基酸序列之间有70%～80%的同源性[]．哺乳动物仅有3种，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它们位于不同的染色体上，其中TGF-β1在体细胞系中所占比例最高(90%)，活性最强．TGF-β1在人体的多项生理过程中发挥着重要的作用，各种实验表明它能够有效抑制多类细胞的增殖，参与了肿瘤发生发展、免疫反应、创伤修复以及细胞间质的形成等各种生理过程[]．特别在肝脏纤维化时肝实质细胞、非实质细胞如HSC、Kupffer及窦周细胞是TGF-β1的主要产生细胞[]． 在大多数细胞中，未成熟的TGF-β1由390个氨基酸组成，在胞内蛋白内切酶的作用下，N-端278个氨基酸形成前导肽，C-端112个氨基酸为成熟肽（图1）．TGF-β1成熟肽具有9个高度保守的半胱氨酸残基，其中8个半胱氨酸残基相互靠近，形成链内二硫键，第9个半胱氨酸形成链间二硫键，将两个单体联结在一起，构成具有生物学活性的二聚体．前导肽与成熟肽被切开后仍以非共价的形式结合，形成一种与受体不能结合的潜在复合物，需通过改变离子强度和pH进行分离，分离后的成熟肽才具有活性[]． 图1. TGF-β1前体结构[] Fig1 Structure of TGF-β1 precursor 目前，TGF-β1表达系统不够完善，后续纯化也比较复杂，故我们在构建TGF-β1表达载体时，将目的蛋白N端引入鼠血清白蛋白分泌信号肽和His6标签，以利于TGF-β1的蛋白分泌及后续纯化．同时，将TGF-β1前导肽中的Cys33突变为Ser以避免影响目的蛋白活性亚基解离，终产品序列与天然蛋白完全一致．pOptiVec-Topo载体（购于invitrogen）通过IRES序列将目的基因和DHFR基因连接形成双顺反子表达载体，IRES能够不依赖5’帽子结构而独立起始翻译，在转录时目的基因和DHFR基因形成同一条mRNA，以共同的效率和比例表达，排除只整合了DHFR基因的假阳性克隆；应用pOptiVec载体稳定转染时有利于阳性克隆筛选，有MTX抗性的细胞均为阳性细胞株． 本研究利用基因工程技术，将来源invitrogen公司的pOptiVec-Topo真核表达载体通过T4连接酶形成闭环的自连载体，然后将TGF-β1基因插入到改造后的pOptiVec真核表达载体中，转染二氢叶酸还原酶缺陷型哺乳动物细胞CHO/dhfr-，通过MTX梯度加压筛选，获得稳定表达TGF-β1的细胞株，在TGF-β1表达产物的分离纯化等技术环节进行工艺研究，并对终产品的质量进行了相关鉴定，意在为今后规模化生产TGF-β1奠定基础． 1材料和方法 材料 C