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酸性磷酸酯酶性质的探究及其固定化中国海洋大学海洋生命学院 2011级生物化学与分子生物学摘要：以紫贻贝消化腺为原料提取一种酸性磷酸酯酶(acid phosphatase，编号：EC 3.1.3.2)，进一步将原酶液盐析、透析、层析纯化，经SDS电泳得到酶带。该酶水解对磷酸苯二钠最适pH值为4，最适温度为35℃，K+、 Mg+、 Na+、 Ca+四种金属离子都能促进酶活，其中，Ca+的促进作用较小。对该酶用两种方法固定化，活性炭吸附和海藻酸钠包埋，其中活性炭吸附后的酶最适温度基本保持不变，而海藻酸钠包埋后的酶最适温度有较大改变。关键词：紫贻贝酸性磷酸酯酶性质固定化酸性磷酸酯酶酸性磷酸酯酶(acid phosphatase，编号：EC 3.1.3.2)属于Ⅱ型非特异性磷酸单酯酶，酸性磷酸酶广泛存在于生物界，从低等生物大肠杆菌,酵母到高等动植物组织，体液以及人类肝脏、前列腺等都发现有酸性磷酸酯酶的存在。它与物质代谢关系密切，通过催化磷蛋白的水解,在细胞调节过程中起着重要的作用。本研究可以确定该酶的最适催化条件，并探究其固定化方法，对其发挥催化功能并大量生产应用具有一定的作用。?1.酸性磷酸酯酶的提取酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，ACP）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。本课题选用紫贻贝消化腺中的酸性磷酸酯酶为材料，将买来的紫贻贝用过滤的海水饥饿处理4~8小时。戴上手套，将紫贻贝解剖后，观察其消化腺的位置，取下腺体与其周围组织，取紫贻贝消化腺，用滤纸吸干后称重142.554g，加入1倍体积预冷的缓冲液和石英砂在搅拌机中完全研成浆状。静置0.5h。继续4℃,4000rpm/min，离心10分钟。将离心管中大部分上清液倒入量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积114ml，然后倒入三角烧瓶中，做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”。计算粗酶液得率（mL/g）（粗酶液得率＝上清液体积/紫贻贝消化腺的重量）为78.46%。将原酶液精确三等分，一份进行梯度盐析提纯；一份放于冰箱内保存，用来做凝胶过滤层析（实验六）；一份用于酶固定化实验。2.标准曲线的绘制酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，ACP）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。本课题选用紫贻贝消化腺中的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验所采用的是Folin-酚法。蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。2.1酶促反应进程曲线所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明了酶促反应随反应时间变化的情况。测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。酸性磷酸酯酶酶液0.5ml 5 mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6) ，可用100 mmol／L磷酸苯二钠水溶液，用0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍。在以不同时间在11支管中加入0.5ml酶，于35℃恒温水浴锅中反应，加入5ml1mol/L碳酸钠溶液终止反应，再加入Folin-酚稀溶液35℃下显色10min,测出吸光度，实验证明10min为最适反应时间。2.2标准蛋白—G250标准曲线考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。R250中的R代表Red，偏红，(C45H44N3O7S2Na ).R250属于慢染，脱色脱的完全，主要用于电泳染色G250中的G就是Green，偏绿(C47H48N3O7S2Na ).G250属于快染，脱色脱的不彻底，主要用于蛋白测定，比考马斯亮蓝R250多二个甲基.λmax=590―610nm.准确称取牛血清清蛋白（BSA）10mg，溶于0.9%NaCl溶液100ml，即为