实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定.doc

实验三 盐析β-D甘露聚糖酶活力测定 一．实验目的 1、掌握β-D甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β糖苷键的机制和理论。。 2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中β-D甘露聚糖活力的操作方法。 二．基本原理 水解含B一1，4甘露糖苷键的甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶，属于半纤维素酶类 。B一甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用 。 三、实验试剂和器材 721型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。pH5.6的醋酸缓冲液 四、实验步骤 1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在8000rpm，离心10min。收集沉淀，加约20毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。 （透析袋处理：剪成15㎝长度，沸水浴中煮10min，捞起、扯开，在一端1㎝处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏为止。处理过程中需戴手套！） 2、酶液倒入透析袋后，另一端1㎝处也用细绳（应用长一点的！）扎紧口，浸于4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯），持续时间1.0h，并不时搅拌，期间每隔20min更换1次4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约150毫升。 注：1、上端口切不可浸于水中，以免水进入袋中胀破透析袋！ 2、透析同时可准备2支50ml的比色管，各加0.25g魔芋精粉，加25mlpH5.6的醋酸缓冲液溶解。操作顺序：先量取25mlpH5.6的醋酸缓冲液加入比色管，在55℃水浴预热，再分次、少量将0.25g魔芋精粉加入，待先加的溶解后再加剩下的！可用竹筷帮助溶解，为免捅破比色管底，切忌用玻棒！溶解完毕，将2支溶有魔芋精粉的50ml比色管始终置于55℃水浴中预热待酶解。 3、将透析好的酶液透析袋置于玻璃漏斗上，剪去上端口一部分，但不要使酶液流出！ 4、2支溶有魔芋精粉的50ml比色管1支加透析好的酶液2ml；另1支加灭活的透析酶液2ml（用做对照），将2管同时置于55℃水浴下反应10 min，取出，放入4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯）冷却，再进行下面操作：（酶液灭活：取5毫升透析酶液置于10 ml的比色管，沸水浴15 min。） 1、事先准备2支25ml的比色管，1支加4.5ml DNS试剂，立即加上述1.5ml酶解反应液；2、另1支加4.5ml DNS试剂，立即加1.5ml对照管的酶解反应液（即用灭活酶水解的魔芋精粉管）；3、2管同时沸水浴5 min后，冷却，定容至10 ml ,于530 nm下测定光吸收值。 在本实验条件下,定义每min产生1 μg还原糖的酶量为一个单位（u）。 五、实验结果：计算β-D甘露聚糖酶活力 实验所得OD530=1.028，此时甘露糖浓度为7.58μg/ml，代入公式计算β-D甘露聚糖酶活力为： 酶活力=7.58×10×20×1/2×1.5/27×1/4=3414（u/g湿基） 七、思考题 1、透析原理及其作用？ 透析是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。