实验二萌发麦苗水溶性蛋白含量测定预习报告.docx

实验二 ：酶活力测定方法的研究——淀粉酶的活力测定生物111班 杨明轩 1102040128预习思考题：1、酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？酶活力指的是酶催化某一化学反应的能力。在测定酶活力实验中，根据酶活力测定所需遵循的三个原则：酶促反应在最适条件下进行，底物浓度足够大，酶促反应速率为反应底物反应的初速率。我认为酶活力测定实验的总体思路应为：选取富含某种待测酶类的生物材料，制备酶提取液，并适当稀释；在适宜的条件（适宜温度及pH）下让酶与足量底物充分反应合适时间；选择合适的方法测定酶促反应产物的浓度，并以此计算待测酶活力。同时还需要考虑在所选材料中是否存在影响实验结果的其他酶存在。如果有，那么就要率先考虑利用蛋白变性等方法使其他酶类不干扰影响结果，即钝化。2、根据上述总体思路你认为在设计酶活力实验时，对结果可信性影响最大的是哪方面？为什么？在该项设计中要注意什么？我认为在本实验中，对结果可信性影响最大的是如何选择一个最为合适的酶活测定条件。因为酶作为具有空间结构的蛋白质分子，其能够在生物体内以一种高效、温和的形式催化生化反应，其原因在于它的特异空间构象，因此这也导致了酶对温度和pH等外界环境条件的极度敏感，稍有改变都会引起酶蛋白分子活性的变化，从而导致酶活无法完全表达，从而无法通过实验测出真实酶活。因此，在本实验中首先应该通过几个预实验确定一个最为合适的酶活条件，确保实验中测定的酶活值为真正地酶活数值。3、淀粉酶和转氨酶的作用各自有何特点？在设计其酶活力测定的具体实验方案时你认为主要应该有哪些针对性的思考？淀粉酶的作用是不可逆的催化淀粉水解。淀粉酶催化的淀粉水解反应不可逆且底物单一即α-淀粉酶和β-淀粉酶均以淀粉为底物，但产物中均有麦芽糖。因此，测定活性时，要么测定二者的总活性，要么通过使其中一种失活钝化以测定另一种的活性。而转氨酶是催化α-酮酸和α-氨基酸之间转氨作用的酶。一方面，反应时可逆的，平衡点接近于1，无论正向反应还是逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生氨基酸，也可测定生成的α-酮酸。另一方面，不同的转氨酶催化的底物不同、产物也不同，能够分别测定不同的转氨酶的活性。但是，作为底物的α-酮戊二酸会对显色造成干扰，限制了其浓度，却又不能保证酶促反应充分进行。因此，当酶活力较大时，应将样品稀释后再进行测定。综上所述，在淀粉酶的酶活测定上，需要适当的温度、pH和反应时间；而转氨酶活力的测定上，需注意底物浓度和辅酶的补给。一、研究背景生命活动依赖于一系列有序的生理生化反应，而这些生化反应的高效有序进行离不开生物体内具有催化作用的生物大分子——酶。在20世纪上半叶，酶的发现成为生物化学领域的三大发现之一。对酶进行深入研究不仅有利于揭示细胞新陈代谢的奥秘，而且有许多实际应用价值。酶学理论和酶制品广泛应用于疾病诊断、作物育种、药物设计、食品加工、工业发酵、纺织印染等领域。因而，对酶的研究一直是分子生物学的重要内容，而其中对于酶活力的测定便是对酶研究的初级阶段中非常重要的一项。在农业生产领域，小麦种子含有大量的淀粉，其淀粉的许多特性优于玉米淀粉。而小麦中又含有许多酶，这些酶在小麦发芽时酶活力都有很大改变，与种子的萌发情况息息相关。在小麦萌发过程中，小麦种子中含有的α-型和β-型两种淀粉酶起到了非常重要的作用。α-淀粉酶能够水解种子中的α-1,4，-葡萄糖苷键，是种子萌发过程中形成的，它可使淀粉糊的粘度迅速下降，起“液化”的作用。β-淀粉酶是一种外切酶，作用于淀粉时，能够从淀粉分子非还原性末端切开α-1,4-糖苷键，水解时沿着淀粉链每次水解掉两个葡萄糖单位，生成麦芽糖，休眠的种子中就含有β-淀粉酶。因此对小麦萌发幼苗中淀粉酶的活力测定，是研究其酶特性的一种手段，也可了解小麦萌发过程中酶的作用特点，并根据实际生产需要对其进行相关操作，减少淀粉酶对小麦淀粉的消耗，从而在生产生活中起到非常重要的作用。基于此背景，本实验计划探究测定小麦萌发幼苗淀粉酶酶活的方法。二、研究目标本实验通过采用小麦萌发幼苗为原料，设计实验测定淀粉酶的酶活力。通过以淀粉酶为对象，在对酶活实验的具体设计细节的讨论和分析上，明确同种生物不同种的酶活测定方法上的不同，学习测定酶活力的常规测定方法。三、研究策略根据酶活力测定的三个基本原则：测定反应初速度；底物量远超过酶量；在最适宜条件下测定。本次实验将进行淀粉酶活性的测定，其总体思路与经典的酶活性测定方法一致即：在适宜淀粉酶发挥作用的条件下，测定淀粉酶催化淀粉水解的产物麦芽糖的产生速率，来表示淀粉酶的催化能力。同时，由于小麦种子中含有α-型和β-型两种淀粉酶，两种淀粉酶作用机制不同，因而本实验计划用使其中一种酶钝化的方法测另一种酶的活力，在最适条件下测定该酶促反应的初速度，以此比较酶活力。另外，在