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详谈EZH2对HSCT6细胞增殖活化的影响 　　肝纤维化是持续性肝脏损伤的共同病理改变过程，主要表现为细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)在肝脏中的大量沉积，其持续发展可形成肝硬化和肝细胞癌。肝纤维化的形成机制目前尚不清楚，研究表明肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)的增殖活化是肝纤维化形成的关键，抑制HSC的增殖活化成为防治肝纤维化的重点。有文献报道，Zeste基因增强子同源物2(enhancerofzestehomolog2，EZH2)在纤维化形成中起重要作用。肝纤维化形成过程中，MAPK/ERK和PI3K/AKT通路被激活并起重要作用。研究发现，EZH2能够激活MAPK/ERK 和PI3K/AKT通路，从而引起疾病。本研究拟应用EZH2的抑制剂DZNep和小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)抑制EZH2的表达，考察其对HSC增殖活化的调控作用，探究其调控机制，以期为肝纤维化的防治提供新的靶点。 　　1　材料 　　1.1　细胞株 　　大鼠肝星状细胞株HSCT6购于南京凯基生物科技发展有限公司。 　　1.2　试剂与仪器 　　DZNep购于Selleckchem公司;TGFbeta;1购于Peprotech公司;噻唑蓝MTT购于Sigma公司;DMSO购于Sigma公司;胰蛋白酶、DMEM培养基为Hyclone公司产品;胎牛血清购于杭州四季青公司;山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司;脂质体LipofectamineTM 2000、OptiMEM购于Invitrogen公司;EZH2、pERK、ERK、pAKT和AKT抗体购于CellSignaling公司;alpha;SMA抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;beta;actin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司;倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司，日本);酶标仪(biotekEL)。 　　2　方法 　　2.1　HSCT6细胞的培养 　　应用含10% 胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2 及饱和湿度条件下进行细胞培养，待细胞长至70% ～80% 密度时进行细胞传代。 　　2.2　DZNep的应用 　　加入DZNep24h前，将细胞传代至6孔培养板，每孔2times;105细胞。实验分正常组、应用TGFbeta;1刺激的模型组、TGFbeta;1刺激并加入DZNep的恢复组。正常组不做任何处理;模型组加入TGFbeta;1刺激终浓度为10mu;g· L-1，TGFbeta;1作用于细胞的时间为48h;恢复组加入TGFbeta;1刺激终浓度为10mu;g· L-1，并加入DZNep刺激终浓度为1mu;mol· L-1，DZNep作用于细胞的时间为24h。 　　2.3　siRNA的合成 　　根据siRNA设计原则，设计针对EZH2基因的siRNA序列，在GenBank表达序列标签(EST)数据库应用BLAST检索，并确认所设计siRNA序列的唯一性，靶向目的基因EZH2的序列设计的两条链，正义链：5prime;GGGCAUCUUUAUCAAAGAUTT3prime;;反义链：5prime;AUCUUUGAUAAAGAUGCCCTT3prime;。同样方法构建阴性对照组的两条链，正义链：5prime;UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3prime;;反义链：5prime;ACGUGACACGUUCGGAGAATT3prime;，与任何编码序列无同源性，由吉玛制药有限公司合成有效siRNA干粉制剂。细胞培养及siRNA转染HSCT6细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5% CO2 培养。转染24h前，传代至6孔培养板，每孔2times;105细胞。实验分正常组、模型组、阴性对照组和EZH2siRNA实验组。正常组不做任何处理;模型组加入TGFbeta;1;阴性对照组转染FAM标记的阴性对照siRNA并加入TGFbeta;1;实验组转染EZH2siRNA并加入TGFbeta;1。用OptiMEM和脂质体作为转染试剂进行转染，使siRNA终浓度均为100pmol· L-1，置于37℃、5% CO2培养箱转染6h后，每组加入完全培养基含TGFbeta;1使刺激终浓度为10mu;g· L-1，继续培养48h，收获细胞。采用荧光倒置显微镜观察各组转染后的细胞形态并判断转染效果。 　　2.4　细胞增殖实验 　　以MTT法检测HSCT6细胞的增殖，分组同上。将培养的HS