谈丹参酮ⅡA 磺酸钠对糖尿病大鼠肾脏SIRT1 和Fox01 蛋白的影响.docVIP

谈丹参酮ⅡA 磺酸钠对糖尿病大鼠肾脏SIRT1 和Fox01 蛋白的影响 　糖尿病肾病( DN) 是糖尿病( DM) 常见并发症，其发病机制与高血糖作为启动因子而诱导产生的氧化应激、多种血管活性物质、生长因子、炎症介质以及肾脏血流动力学改变等因素的综合作用有关。SIRT1 是酵母染色沉默信息调节因子2 ( silentmating type information regulation 2) 的哺乳动物同源体，是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD + ) 的组蛋白去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子，在体内参与调控哺乳动物细胞寿命的不同信号通路及糖代谢，胰岛素分泌等多条代谢途径。研究认为沉默信息调节因子2 的哺乳动物同源体( SIRT1) 是防治糖尿病及其相关性疾病的重要靶点之一，激活SIRT1 对2 型糖尿病具有重要的防治作用。叉头转录因子( Fox01 ) 是SIRT1 去乙酰化的直接的功能靶点，Fox01 介导SIRT1 依赖的转录活性，是体内调节糖代谢的一个重要的靶点。丹参酮ⅡA磺酸钠( TSN) 具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环等药理作用。本实验通过建立糖尿病大鼠模型，探讨丹参酮ⅡA 磺酸钠干预后对糖尿病大鼠SIRT1 和Fox01 蛋白影响，初步探索丹参酮ⅡA 磺酸钠对DN 的保护作用机制。 　　1 材料与方法 　　1. 1 试验 　　药物丹参酮ⅡA 磺酸钠由上海第一生化药业有限公司，国药准字 　　1. 2 动物 　　清洁级近交系雄性SD 大鼠( 由湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号SCXK( 鄂) 2010-0007) ，3月龄，体重150 ～ 200g，动物室饲养温度23 plusmn; 2℃、湿度50% ～ 60%、标准饲料喂养，光照周期12 小时。 　　1. 3 试剂 　　链脲佐菌素为Sigma 公司生产。链脲菌素( STZ) ，Sigma 公司; 超氧化化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 及谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 试剂盒( 南京建成) ; SIRT1、Fox01 抗体、ac Fox01 抗体、beta;-actin 抗体、gamma; -Tubutin 抗体( Santa Crtz，USA) 。 　　1. 4 方法 　　大鼠适应性喂养一周后，用柠檬酸缓冲液( 0. 1mol /L，pH4. 5) 新鲜配置STZ( 65mg /kg) 单次腹腔注射， 72 小时后空腹血糖ge;16. 7mmol /L 作为糖尿病模型建立成功，实验分成4组: 正常对照组，糖尿病组，丹参酮ⅡA 磺酸钠组( 分别于DN 模型建立后丹参酮ⅡA 磺酸钠腹腔注射，10mg /kg、20mg /kg) ，每组各10 只，其中正常对照组大鼠10 只，腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液，所有动物第12 周处死。整个过程不使用胰岛素，所有动物自由进食。于实验的第4、8 周及第12 周前一天将实验动物放进代谢笼，禁食，收集24 小时尿，作尿蛋白和尿肌酐检测。第12 周时各组空腹实验动物用2% 戊巴比妥钠麻醉后，下腔静脉采血，观察血浆中内皮素( ET) 、血栓素( TXB2) 、6-酮-前列腺素F1alpha;( 6-keto-PGF1alpha;) 的变化，部分血样测血肌酐、血糖、血胆固醇、血抗氧化酶活性和MDA 含量，部分血EDTA-k2 抗凝，血样于室温下半小时内分离，4℃储藏时于2 小时内分离， 3000rpm离心10 分钟，取血浆分析。迅速取出肾脏，称其总质量，取其平均值( mg) ，与体质量( g) 之比，即为肾质量指数( mg /g) 。肾组织于冰生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，部分肾组织分离皮质，制备10% 的肾脏组织匀浆，测定肾脏MDA 水平、SOD 活性和GSH-Px 活性。部分肾组织去除包膜，作长轴方向对切， 10%中性福尔马林固定后，石蜡包埋，用于病理检查，其余肾组织保存于- 80℃冰箱备用。 　　1. 4. 1 生化指标血胆固醇、血肌酐、尿肌酐采用Beckmam 全自动生化分析仪测定; 血糖测定采用美国罗氏公司血糖测定仪; 尿白蛋白/肌酐( A/C) 采用免疫比浊法检测。 　　1. 4. 2 抗氧化指标测定肾组织中SOD、MDA、GSH-Px，操作按试剂盒( 南京建成) 说明书进行。 　　1. 4. 3 内皮素( ET) 、血栓素( TXB2) 、6-酮-前列腺素F1alpha;( 6-keto-PGF1alpha;) 测定采用ELISA 法测定，具体操作按照说明书进行。 　　1. 4. 4 Western 印迹检测取总蛋白75mu;g 经12% 十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至