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环境中微生物的检测和分离纯化生32 程雨婧 2013012406组别：周五班 同组成员：谢丰实验时间2015年4月10日 一、 实验目的 1. 熟悉常用微生物培养基配制与灭菌的方法及原理。 2. 学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物的分离，纯化。 3. 用平板划线法和稀释法分离微生物。 4. 认识微生物存在的普遍性，理解无菌操作的重要性。 二、 实验原理 (一)微生物的分离与纯化微生物聚集最多的地方是土壤，土壤是各种微生物生长繁殖的大本营。空气里悬浮着无数细小的尘埃和水滴，它们是微生物在空气中的藏身之地。各种水域中也有无数的微生物。居民区附近的河水和浅井水容易受到各种污染，水中的微生物就比较多。大湖和海水中，微生物较少。从人和动植物的表皮到人和动物的消化道，也都经常生活着大量的微生物。 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对雪养、酸碱度、浓度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物．再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。 (一)微生物的分离与纯化 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。 三、 实验材料，仪器和用具 1. 仪器和用具 仪器：取液器（5000ul 、1000ul 、100ul各一支）；培养箱。 用具：接种环；酒精灯；平板；涂布棒；培养皿；无菌100ul, 1000ul枪头；记号笔。 2. 材料和试剂 菌源: 土样（浓度10-2），大肠杆菌（液体），粘质赛氏杆菌（固体平板），枯草杆菌（液体），金黄色葡萄球菌（液体），身边环境。 培养基: 牛肉膏蛋白胨培养基每人10个，小组20个。 试剂：0.9%无菌生理盐水 四、 实验步骤 1. 从土壤中分离微生物 1) 采土样 选择肥沃土壤,去表层土,挖5~20cm深土壤,装入烧杯,带回实验室。 2) 制备土壤稀释液 a) 称取土样1.0g， 放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，用手振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。（以上步骤已由助教完成）b) 用100ul的无菌吸头从中吸取0.1ml土壤悬液，注入事先分装有0.9ml无菌水的试管中，吹吸3次，摇匀（10-3）。类推制得10-4、10-5、10-6的土壤悬液。 3) 涂布 用无菌枪头，分别吸取10-4、10-5、10-6浓度土壤稀释液100ul，均匀放入写好稀释度的培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒涂匀，每个浓度做3个平板。 4) 培养 将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于32℃温箱培养24h；统计所长出的菌落数。 5) 菌落计数 有较大片菌苔生长时，弃用，以无片菌苔生长的平板计数；若成片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，此半个平板计数后乘以2可得总数。 最后得到平均菌落数后，可按如下公式计算细菌含量： 2. 单菌落划线分离试验 用接种环在固体平板上或菌液中取菌，在牛肉蛋白胨培养基平板上进行划线。35℃培养24h后观察划线分离结果。（2个平板/人） 3. 周围环境中微生物的观察 1）取样 a) 取一个平板，分成4区，做好标记。用未洗过的手指头以及洗过1次，2次，3次的手指头，分别在4个区上涂抹b) 取两个平板，一个打开皿盖，置实验台上（空气中）10min；另一个按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min。 c) 取一个平板，取100ul 河水，均匀放入培养基平板上，用涂布棒涂匀。 d) 取一个平板，往培养基上放置两根头发，并用涂布棒压紧。 e) 取一个平板，取100ul 酸奶，均匀放入培养基平板上，用涂布棒涂匀。f) 取一个平板，取100ul 自来水，均匀放入培养基平板上，用涂布棒涂匀。 2） 培养 以上采样的平板用报纸包好倒置32℃培养箱里培养24小时，取出后用相机将实验结果拍照记录。 五、 实验结果与分析 1. 从土壤中分离微生物 稀释度实验结果描述10-4菌落分布比较均匀，密度较小。菌落大致可分为两种，一种菌落较大，呈不透明乳白色，边缘不光滑，另一种则是淡黄色透明的小菌落，边缘光滑10-5菌落数大幅下降，不到十个，菌落类型大致还是两类，图中透明淡黄色的小菌落不是很明显，但是实际可观察到10-6看不到菌落，说明稀释倍数太高表1土壤稀释液微生物计数结果稀释浓度菌落数平均值微生物浓度（个/g土壤）12310-4无法计数604552.55.3×10610-5