上海交通大学微生物实验实验九动物病毒培养研究报告.ppt

实验九 病毒的分离与培养 p101 实验目的 理解常规的病毒培养的基本方法 掌握利用鸡胚培养病毒的原理 掌握鸡胚接种的基本路径 学会鸡胚的鉴别 病毒的种类 专性活细胞寄生 动物病毒 鸡胚接种 细胞培养 植物病毒 细菌病毒 噬菌体 从病料中分离病毒 一、样本的采集与处理 1、一般原则： 合适的时间，合适的病变部位，合适的处理和保存方法 一般都要4℃保存 2、病料的种类 动物样本： （1）心、肝、肺、脾、肾脏和淋巴结等实质性器官 （2）各种液体病料 （3）肠内容物和肠壁 （4）皮肤病料 （5）骨 （6）脑、脊髓 植物样本： 发病植株的根、茎、叶、花、果等 环境样本 水样、土壤、动物粪便等 ； 采集病料应具有针对性：在采集病料时应有重点地采集有关脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。在无法估计病因时，可全面采集病料。进行流行病学调查、抗体检测、群体健康评估或环境卫生检测时，样品的采集数量不能太少，应具统计学意义。 B. 无菌采样：采集所用的器械、样品管等均应消毒灭菌，采集过程应保持无菌操作，不同个体、不同组织样品应作好标。 C. 采集新鲜病料：动物发病后应立即采集病料，否则，尸体腐败会影响采样和检测效果，特别是用于病理学检查的病料更应及时采集。 注意事项 3、送检病料样本的标记 （1）送检病料的物种、年龄、性别、发病日期、死亡时间等。 （2）流行病学、临床表现、病理剖检等初步诊断材料。 （3）免疫接种和用药治疗情况。 （4）病料中是否加有一些特殊的保护剂。 （5）送检的目的和要求。 （6）姓名和联系方式。 4、待检病毒材料的处理： （1）组织材料需经剪碎、研磨后，以汉克氏液作1：10稀释，每毫升加入青、链霉素各1000IU，再反复冻融3次，使病毒从细胞中释放出来，3000-4000转/分钟离心20分钟，取上清液微孔滤膜过滤后作为接种物。 （2）分泌物、粪便等材料则可直接以汉克氏液作1：10稀释，每毫升加入青、链霉素各1000IU，4℃放置过夜，3000-4000转/分钟离心20分钟，取上清液作为接种物。 （3）接种物在接种前需做细菌培养试验，只有无菌接种物才可进一步使用。 （4）植物样本经剪碎、研磨、离心、过滤后接种植株 哪些方法可以分离培养病毒？各有什么优点？ 鸡胚接种基本原理 鸡胚培养的优点： 鸡胚作为病毒的敏感细胞，能支持病毒完成从吸附到基因组复制、转录、蛋白质合成、装配、释放的整个生命过程，从而使得病毒得以增殖。 接种路径：羊膜腔，尿囊腔，绒毛尿囊膜，胚体和卵黄囊接种等 不同的病毒必须采用不同的接种路径 鸡胚培养病毒的用途：分离、增殖、毒力测定、疫苗制备等。 动物病毒 实验动物 鸡胚 多种细胞培养 接种前的准备 鸡胚的孵化 鸡胚的活力鉴别 样本的前处理 确定采用的接种路径 本次实验严格的无菌操作 实验步骤 1、照蛋： 活胚：有鲜红的血管、摇动有黑点、黑点运动灵活。 死胚：血管比较暗、摇动时黑点运动不灵活 无精蛋：均匀透明、无血管和黑点 2、划出气室 找出血管相对较少的部位 3、消毒气室 先用碘酊棉球，在用酒精棉球脱碘 4、打孔器打孔 在气室的斜上方中心 5、病毒接种 灭菌注射器取0.2毫升病毒液（鸡新城疫病毒的稀释液？），沿孔垂直插入约1.5厘米进行接种（尿囊腔接种） 6、石蜡封闭接种孔（石蜡加热时温度不要太高，以防燃烧） 7、鸡胚培养 标记后，于37℃培养48-72小时。 24小时内死亡鸡胚必须剔除 （为什么？如何判定非病毒引起的死亡？） 病毒是否有增殖？ 8、下次实验要验证病毒，观察鸡胚的变化 实验报告 实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题 p106(1),(2), (4) 下次实验 病毒的检测（血凝和血凝抑制试验）p