遗传实验参考 2012 4.不同染色体上的转基因果蝇的杂交重组和鉴定_30760956.docxVIP

4． 不同染色体上的转基因果蝇的杂交重组和鉴定（开放实验） 实验目的： 把插入在不同染色体上的不同目的基因（分别处于两个品系果蝇中）通过重组交换整合到同一品系果蝇的相应染色体上，并得到可以稳定保存的品系（balanced或homozygous）。 即利用A/A;+/+和+/+;B/B的果蝇重组为A/A;B/B的果蝇。 背景知识： 1. Gal4/UAS, Gal80系统 GAL4/UAS系统是目前果蝇中十分常用的实验系统（见下图说明）。该系统利用组织特异性的启动子或增强子，将GAL4基因与启动子或增强子相连接,建立GAL4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制GAL4的表达。另外，将UAS与靶基因融合，建立带有UAS-靶基因的转基因系。在杂交后代中,特异性表达的GAL4能以同样的方式调节UAS-靶基因的表达。 图示. 果蝇中GAL4/UAS，Gal80系统 Gal80ts是一个用于辅助Gal4-UAS系统的新方法，最早的报道出现于2003年。Gal4-UAS的表达虽然在空间上可以控制，但由于Gal4蛋白的持续表达，我们是无法在时间维度上控制目标UAS的表达的。因而通过这一系统表达的蛋白会从发育阶段开始，一直影响果蝇的生理过程。我们很难确定这一蛋白的起效时间实在发育阶段，还是成体阶段。Gal80ts的出现可以克服这一缺点。在低温条件下（18℃），GAL80会与GAL4蛋白结合，阻止GAL4和UAS的结合，使得这一表达系统失效，即没有蛋白表达。而在我们希望表达蛋白的时候，可以对果蝇进行热激（30℃），使得GAL80蛋白不能与GAL4结合，GAL4得以与UAS结合，表达特定蛋白。 2. 转基因果蝇的重组 在制作转基因果蝇的过程中，一般只能在同一染色体上操作。若我们希望获得具有两个插入基因的果蝇，且这两个基因位于不同的染色体上，就可以利用杂交实现这一过程。 具体来讲，此次实验的elav-Gal4位于一号染色体（性染色体），Gal80ts位于二号染色体。现有纯合的elav-Gal4果蝇，和Gal80ts果蝇。我们希望获得一种果蝇，其一号染色体上具有纯合的elav-Gal4，同时二号染色体具有纯合的Gal80ts。这样，在低温条件下，Gal80会抑制elav-Gal4的作用，而高温条件下Gal80ts失效，elav-Gal4得以表达。 实验中需要利用平衡子来完成这一过程，平衡子具有相应的性状，且带平衡子的果蝇相应染色体不能发生重组，使得杂交过程和鉴定方法更为简单。 为鉴定这一结果，我们需要利用UAS-GFP果蝇，与重组后的果蝇杂交后，验证重组果蝇。 实验材料： 平衡子：1、2： 一号染色体对应性状：雄蝇、纯合雌蝇棒状眼，杂合雌蝇缺刻眼。 二号染色体对应性状：卷翅/sp（腿侧部两根毛，WT仅一根） elav-Gal4，一号染色体，全脑表达 Gal80ts：二号染色体，全身表达 UAS-GFP：在Gal4正常时，表达绿色荧光蛋白 实验步骤： 1、 进行实验设计，写出实验方案，实验方案中应包括所用亲本的性状（注意雌雄蝇的选择）、杂交方法、杂交所需的代数，以及重组果蝇的保存方法，鉴定方法等。 2、 进行杂交实验得到目的果蝇。 3、 通过荧光显微镜进行重组鉴定。 注：此实验周期较长，但是无需数大量的果蝇数目。