第3章第7节人类基因组的染色体作图.pptVIP

* * 三、人类基因组的物理作图法（二） （二）物理作图基本方法 1．由长到短作图（top-down maping） (1) 完全酶切 (2) 先长切，用识别顺序少的限制酶，100Kb-1000 Kb 再短切，用识别顺序多的限制酶，酶切长片段。 (3)连接 优点：汇成的图谱比较完整 缺点：不够精细，分辨率较低 * * 三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 2.由短到长作图（bottom-up maping） 用有很多识别序列的限制性内切酶通过减少酶量，缩短反应时间，作部分酶切（partial digestion）。 特点是一些片段相互之间有重叠部分，因此部分酶切的片段两两连接，逐渐延长片段。 优点：分辨率较高，比较精细； 缺点：断片段易丢失，连接时可能出现空挡（gap） 叠连群是彼此间可通过重叠序列而连接成较长片段的一组短片组。 * * 三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 部分酶切 * * 三、人类基因组的物理作图法 (三)DNA序列的测定 1.化学测序法 (chemical method of DNA sequencing) 又称Maxam-Gilbert法, 先要获得单链DNA片段，100～200核苷酸，待测的5末端用32P标记，然后分成4份，分别以4种化学方法部分降解DNA，使DNA片段在含特定碱基处切断，产生四组随机片断，然后各个处理所产生的DNA随机片段混合物分别用同一聚丙烯酰胺凝胶电泳，把不同长度的片段分开，根据所得的电泳的放射自显影，从底部最短的条带向上,一条条依次地读取，即可得碱基顺序。 * * 32P—C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G— 三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定 样品分成4份 32P—C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G— 分别作部分化学降解 C+T 专一反应 C 专一反应 G+A 专一反应 G 专一反应 G T T C G A T T A G C C C * * 三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定 2．双脱氧法（dideoxy technique） 又称链终止法(chain terminator technique) 是英国Sanger发明的，又称Sanger法 O 碱基 5’ －CH2 H OH 3’ O 碱基 5’ －CH2 H H 3’ * * 三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定 2．双脱氧法（dideoxy technique） 单链DNA模板→寡核苷酸DNA引物→分成 4份，加入dATP，dGTP，dCTP，dTTP其中一种有放射性，分别加入双脱氧核苷酸（ddATP， ddGTP，ddTTP，ddCTP）, 双脱氧核苷酸可以替代脱氧核苷酸掺入模板的DNA的互补链中，使DNA合成终止。 * * 三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定 4种处理，对应4种终止方式 +ddATP +ddCTP +ddATP +ddGTP G T T C G A TT A G C C C —C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G— C C C G A T T A G C T T G Klenow酶+4NTP+1ddNTP 使引物延伸 —T—T—T—A—G—C—C—G—A—T—C—C—A— 模板链 互补链 终止 * * 三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定 3． DNA自动测序 同Sanger法，不同的是用4种不同的荧光染料标记引物，分别对应4种双脱氧核苷酸，把4种反应物混合后，走聚丙烯酰胺凝胶电泳，激光照射，荧光检测器。 本节结束 链接到 第一～三节 性别决定与分化 第四节 剂量补偿效应 第五节 连锁基因的交换与重组 第六节 真菌类的遗传学分析 HAT培养基 （HAT medium） HAT系次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径(de novo pathway)和中间合成途径（salvage pa-thway)。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。在这种情况下，利用HAT