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第三章 酶的分离纯化 (1)研磨法 适用于绝大多数微生物细胞 原理：珠磨机的破碎室内填充玻璃或氧化锆微球。在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。 (2) 捣碎法 动、植物材料 高速捣碎器操作简便，破碎效果好，但易引起局部温度过高，必须考虑酶的特点谨慎使用。 (3) 匀浆法 适用于酵母和大多数细菌细胞 原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，在撞击力和剪切力等的综合作用下破碎。 (1)渗透压法 最温和的细胞破碎法 适于易于破碎的细胞，如动物细胞和G-菌。 将细胞置于高渗透压的介质中，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进入细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。 (2) 冻融法 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化(反复多次操作) (3) 超声波破碎法 原理：在超声波作用下液体发生空穴作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，从而使细胞破碎。 很强烈，适用于多数微生物的破碎。 有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿 表面活性剂：Triton、Tween 条件温和、具有选择性。 缺点：酶的价格昂贵 自溶法：不好 理由：①自溶液中成份十分复杂；②有破坏待分离酶的危险。 3.3 酶的分离方法 3.3.3 过滤与膜分离 过滤：在压力(或真空)的情况下将悬浮液通过过滤介质使达到固—液分离的目的。 （1）滤浆（料浆）— 悬浮液 （2）过滤介质 — 多孔物质 （3 ）滤饼（滤渣）— 被截留的固体物质 （4）滤液（母液）— 通过过滤介质的液体 1．加压膜分离 以薄膜两边的流体静压差为推动力。 2．电场膜分离 在半透膜的两侧分别装上正、负极，在电场作用下移动。 3．扩散膜分离 利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜到膜外。 3.3.4 层析分离(色谱分离) 2、分配层析 原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离 固定相：极性溶剂（例如水、稀硫酸）。 和多孔的支持物(纤维素粉，滤纸等)紧密结合，使呈不流动状态； 流动相：非极性的有机溶剂。 正相色谱：固定相是极性，流动相是非极性的 *反相色谱：固定相是非极性的,流动相是极性的 6、层析聚焦 原理：根据两性电解质分子间等电点的差别。 固定相：在较宽pH范围内具有缓冲作用的多缓冲离子交换剂 流动相：多缓冲剂 当向层析柱内通入与柱内初始pH不同的多缓冲剂时,柱内形成连续的pH梯度，欲分离酶液中的各组分在此系统中会聚焦于与其等电点相当的pH位置上，使不同等电点的组分得以分离。 按支持体的不同，可以分为： 纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 自由电泳 等电聚焦电泳 (一)有机溶剂萃取 有机溶剂——轻相 含产物的水溶液——重相 萃取：产物从水相转移到有机相。 反萃取：在另一条件下，使产物从有机相转回到水相，称为~。 有机溶剂：丙酮、丁醇、苯酚等。 (二)双水相萃取 双水相： 高聚物—高聚物 聚乙二醇(PEG)／葡聚糖(Dex)； 高聚物——无机盐 PEG／磷酸盐，PEG／硫酸铵 因两相均含有较多的水，所以称之为双水相。 (三)超临界萃取 利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而分离。 基本思想： 超临界流体在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离 超临界流体特点： 密度接近液体－－萃取能力强 粘度接近气体－－传质性能好 常用萃取剂 极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难） 非极性萃取剂：二氧化碳（易） (四) 反胶束萃取 利用反胶束将酶从混合液中萃取出来。 表面活性剂在非极性有机溶剂中形成一种聚集体 微团和反微团 微团： 表面活性剂的极 性头朝外，疏水 的尾部朝内，中 间形成非极性的 “核” 反微团： 表面活性剂的极 性头朝内，疏水 的尾部向外，中 间形成极性的“核” 3.4 酶的浓缩、干燥与结晶 1)真空干燥 可密闭的干燥器与真空装置相连，一边抽真空一边加热，使酶在较低的温度下蒸发干燥。 2 )冷冻干燥 先将浓酶液降温到冰点以下，使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为气体，使酶干燥。 产品质量高，保持完整的结构。 成本较高，适于对热很敏感而价值较高的酶。 3 )喷雾干燥 将酶液通过喷雾装置喷成直径为几十微米的雾滴，分散于热气流之中，水分迅速蒸发而使酶