第五章 DNA的复制.pptVIP

第五章 DNA的复制 第一节 DNA复制的机制 1958年，Meselson和Stahl通过实验证实DNA的复制是按半保留方式复制的。 正常情况下，普通培养基培养的大肠杆菌的DNA二条链均无放射标记（14N14N），在含15N培养基上培养数代后二条DNA链均带有放射性标记，为15N15N，再次转移至变通培养基上培养，其F1代DNA以半保留方式复制后形成杂合链15N14N，其中的带15N标记的链来自亲本15N15N的一条链，不带标记的14N链是在普通培养基中N14新合成的新生链。继续培养至40分钟，由F1代形成F2代，后代中的DNA有的是14N14N，有的是15N14N。 第二节 E.coli DNA的复制酶和相关蛋白因子 一、DNA的聚合酶 （一）原核DNA聚合酶：一个能够在模版链上合成新的DNA链的酶叫做DNA聚合酶。原核和真核生物中都包含有多种DNA聚合酶的活动。只有它们中的一部分是真正参与了复制的；有的时候这些酶叫做DNA复制酶。其它的一些扮演了复制过程中的辅助角色并且或者参与了替换被破坏的序列的DNA合成的修复工作。 1957年首次从E.coli中分离到了DNA聚合酶I（DNA polymerase I），随后又发现了DNA Pol II，DNA Pol III。三种聚合酶的比较见下表. Nick translation 又叫缺口翻译或缺口平移，指以适量的DNase I在待标记的双链DNA的每一条链上产生若干个单链缺口；再利用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的 5’-3’外切酶活性和5’-3’ 聚合活性，在缺口处的5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口，随着缺口在DNA链上的移动，标记的核苷酸就掺入到新合成的DNA链中从而形成均匀标记的DNA探针。 是实验室常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。 二、引物酶（Primerase）引发酶 已知任何一种DNA聚合酶都不能从头起始合成一条新的DNA链，而必须有一段引物，这段引物大多为一段RNA，1-10个核苷酸。引物与一般的RNA不同，它们合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合，这种引物是由一种特异的RNA聚合酶所合成的，称为引物酶（引发酶）。 大肠杆菌的引物酶由dnaG基因编码，60KD，一条单链。这种酶单独存在时不活泼，当与有关的蛋白相互结合而成一个复合体时才有活性，这种复合物称为引物体。 使用引物的原因：1）减少致死突变，因为DNA复制时最初合成的几个核苷酸出现错误的概率较大，以RNA为引物，可将这种错误避免或减少，RNA引物最终将被切除；2）提供3`-OH。 三、DNA连接酶 催化DNA片段3`-OH与5`-磷酸基形成磷酸二酯键，使DNA片段相连接的酶。该酶对缺碱基的二端不能连接，只能连接核苷酸排列正确、相邻的3`-OH和5`-磷酸。 DNA后随链的复制是不连续的，岗崎片段形成后，其5`-端的RNA引物通过DNA Pol I催化缺口移位，使RNA降解，并同时将缺口补上，剩下的3`-OH和5`-磷酸基由DNA连接酶催化形成磷酸二酯键，使各片段DNA连接。 五、螺旋酶（helicase）?又称解旋酶 是促进DNA的两条链分离的 一类酶。解旋酶利用ATP水解酶的能量使DNA双股链分离，并在DNA上沿一定的方向移动。 大肠杆菌的解旋酶有DnaB，PriA，Rep蛋白，它们之间的特性有些不同，移动的极性也有差异，DnaB沿5`→3`方向移动，PriA和Rep蛋白沿3`→5`方向移动。 第三节、不同生物DNA的复制 一、大肠杆菌DNA的复制 大肠杆菌基因组为双股环形DNA，其复制由单一原点出发，按双向的θ方式进行，在原点解链，先导链连续合成，后随链不连续合成，最后完成复制。 （一）复制的起始： 大肠杆菌原点为OriC，位于天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操纵子之间，共有245bp，含3个13bp和四个9bp的两个系列的重复单位。 由大肠杆菌编码的Dna蛋白（解旋酶）作用于OriC而引发复制的起始。步骤： 1）初始引物复合物的形成：首先，Dna蛋白识别和结合于OriC的9bp重复复位形成复合物，由20-410个DnaA蛋白形成核心，负超螺旋的OriC包裹在外，随后，DnaA蛋白使13bp重复单位解链，形成开放复合物，这一过程需要DnaA蛋白和ATP； 2）Gyrase（TopII）、SSB、Hu蛋白DnaB、DNAc相继进入DNA的熔解区，形成前引物化复合物（初始复合物）。DnaB为解旋酶进入后，替换DnaA，占据DnaA的位置，使DNA双向解链，形成两复