第三节蛋白质的理化性质及其分离纯化.ppt

第三节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化 一、蛋白质的理化性质 （一）蛋白质的两性电离 （二）蛋白质的胶体性质 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 （四）蛋白质的紫外吸收 （五）蛋白质的呈色反应 （一）蛋白质的两性电离 蛋白质是由氨基酸构成的，其两端及侧链都含有可解离的酸性基团或碱性基团，因此在不同pH的介质中，蛋白质的带电状态就不同。 蛋白质的等电点（pI） 概念：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 pI是蛋白质的特征性常数。 利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。 pH pI 带负电荷 pH pI 带正电荷 体内多数蛋白pI为5.0左右 ， pH为7.45 时 多数蛋白带负电荷。 如pI 偏于碱性－碱性蛋白质 鱼精蛋白 组蛋白 如pI 偏于酸性－酸性蛋白质 胃蛋白酶 丝蛋白 （二）蛋白质的胶体性质 颗粒大小：在1～100nm之间。属胶体。因此溶于水，成为亲水胶体。 稳定亲水胶体的因素： 水化膜 表面电荷 不通透性：半透膜 毛细血管壁 （三)蛋白质的变性、沉淀和凝固 1. 变性（denaturation） 概念: 在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。 变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。 变性因素： 物理因素：加热、加压、超声波、 紫外线 化学因素：胍、脲、有机溶剂、 强酸强碱、 SDS ?-巯基乙醇、 重金属离子 生物碱试剂 蛋白质变性后的理化和生物学性质改变： 溶解度↓ 生物活性丧失及易被蛋白酶水解 粘度↑ 结晶能力消失、 应用：消毒灭菌 低温保存生物制剂 复性(renaturation)：蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性。 不可逆变性 2. 沉淀 (precipitation) 蛋白质的沉淀：蛋白质的肽链相互聚集而从溶液中析出的现象。 + 蛋白质的凝固作用（coagulation） 蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将 pH 调至pI，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。 （四）蛋白质的紫外吸收 波长：280nm 引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸和酪氨酸( Trp, Tyr)的共轭双键。 可用于蛋白质的定量 （五）蛋白质的呈色反应 茚三酮反应：肽和氨基酸的自由氨基与茚三酮生成蓝紫色化合物。 双缩脲反应：蛋白质和肽类分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈紫红色。 呈色反应可用于蛋白质的定性和定量。 二、蛋白质的分离和纯化 （一）丙酮沉淀及盐析 （二）电泳 （三）透析 （四）层析 （五）分子筛 （六）超速离心 （一）丙酮沉淀及盐析 原理：破坏亲水胶体的两个稳定因素。 丙酮沉淀：0～4℃，10倍于蛋白质体积 的丙酮，沉淀后立即分离。 盐析：将大量中性盐（如硫酸铵）加到 蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水 溶液中的稳定因素，而使之从溶 液中沉淀析出的现象。 （二）电泳（electrophoresis） 蛋白质在电场中可向其所带电荷相反的方向移动，这种现象叫电泳。 由于不同的蛋白质带电多少、分子量大小及分子形状不同，因此在电场中泳动的速度就不同，从而可将蛋白质分离开来。 应用：分离蛋白质和测分子量 （三）透析（dialysis） 蛋白质是高分子化合物，不能透过半透膜。将蛋白溶液装入用半透膜制成的透析袋中，可将蛋白质溶液中的小分子化合物除去，这种方法叫透析。 如在袋外放吸水剂（如聚乙二醇）还可达到浓缩的目的。 应用：除盐和浓缩 超 滤 利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。 超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。 （四）层析（chromatography） 离子交换层析：根据蛋白质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离目的。 应用：分离蛋白