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第二章微生物的纯培养和显微技术 本章要点 微生物的分离和纯培养1、无菌操作技术2、涂布平板法和划线分离法3、选择培养基分离法和富集培养法4、微生物的保藏技术 培养物：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。 纯培养物：只有一种微生物的培养物。 纯培养技术：把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。 第一节 微生物的分离和纯培养 一、无菌技术 在分离、转接及培养纯培养物时防止其配其他微生物污染的技术称为无菌技术。 1.1 微生物培养的常用器具及其灭菌 ●灭菌方法： 灭菌(Sterilization)：用物理或化学方法，杀死物体表面和内部的一切微生物，包括芽孢和孢子。 消毒(Disinfection)：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞） 防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上 的生长 高压蒸汽灭菌和干热灭菌法 1.2 接种技术 微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本的操作技术，选择一个好的接种方法，对微生物的分离、纯化、增殖和鉴别都很重要。 接种方法：斜面接种、液体接种、穿刺接种 、固体接种、点接种 2.1 稀释倒平板法 2.2 涂布平板法 世田北里孢菌的产气孢子 多毛的链霉菌孢子链 放线菌菌落形态 ◆放线菌的孢子常具有色素，呈白、灰等颜色，是分类的重要特征之一。 ◆菌落由菌丝体组成，菌丝按功能分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝，其中孢子丝的形态特征是放线菌的重要鉴定指标。 2.2 放线菌的一般形态 　链霉菌的不同特征孢子丝形态 * 三角瓶、试管、平皿、培养基（固、液） 高压蒸汽灭菌锅 适用于培养基0.1MPa，121℃ 灭菌15-30min 干热灭菌箱 适用于玻璃器皿 160-170℃ 灭菌1-2 h 为了确保纯种不被污染，在整个过程中，必须进行严格的无菌操作。 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用接种和分离工具 无菌操作转接培养物 无菌操作箱（ａ）及其操作（ｂ） 接种工具一般采用易于加热和冷却的镍铬合金等金属制备。 超净工作台使用前用紫外灯或化学药剂灭菌，或通入无菌空气。 二、用固体培养基分离纯培养 ● 菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 ● 菌苔：固体培养基表面众多菌落连成一片时，称为菌苔。 ● 培养平板：熔化的固体培养基倒入无菌平板，冷却凝固后，盛有固体培养基的平板。 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 10-1 10-2 10-4 10-5 10-3 10-6 稀释液 4.5ml 无菌水 0.1ml 0.1ml 0.1ml 取稀释好的菌悬液0.1mL加入平板中，将冷却至50℃左右的琼脂培养基倒入平板中。迅速旋转培养皿,使培养基和稀释液充分混合,水平放置,待凝固后,倒置于到恒温培养箱中培养。 缺点：对热敏感的细菌容易死亡，严格好氧菌的生长受限制。 平板表面及内部均有菌落生长 ※加样: 将稀释好的菌悬液0.1mL加入琼脂平板中。 ※涂布: 右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液轻轻地来回推动，使之分布均匀，待涂布的菌液干后,倒置于到恒温培养箱中培养。 菌落仅生长于表面 注意：每划完一个区域，要灼烧接种环，用力要轻勿划破表面。 倒平板—划线—培养—挑单菌落—纯培养 2.3 划线分离法 各种微生物形成的菌落特征 三、用液体培养基分离纯培养 适用于在固体培养基上难以生长的菌类，如原生动物、单细胞藻类。 方法：大量稀释，制备大量的平行样品。 四、单细胞分离 适用于载混杂微生物群体中不占数量优势的种类。 方法：显微分离法。个体大小与分离难度成反比。 五、选择培养分离 5.1 利用选择性平板直接分离 利用选择培养基将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 选择性培养基：根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。 用于选择性培养基的若干抑制剂 5.2 富集培养 利用富集培养技术从土壤中分离能降解p －羟基苯甲酸的微生物 根据待分离微生物的特点设计富集培养基，用于从环境中富集和分离某种微生物。（目的微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集而占优势，从而容易达到分离该种微生物的目的。