蛋白组学技术选读.ppt

蛋白质组学研究技术 12生物制药第一组 主要内容 蛋白质组学研究背景 1 蛋白质组学定义及内容 2 蛋白质组学研究技术 3 蛋白质组学研究进展 4 人类基因组计划结束给科学工作者极大鼓舞，同时也引出了更多的问题： 大量涌现出的新基因，它们有什么功能？编码什么蛋白？在生命过程中发挥什么样的作用？ 这些问题靠传统的研究方法不可能解决。蛋白质组（proteome)和蛋白质组学（proteomics)的概念就是在这个基础上提出的。 一、蛋白质组学研究背景 二、蛋白质组学定义及内容 蛋白质组学是蛋白质和基因组研究在形式和内容两方面的完美组合，该技术致力于研究某一物种，个体，器官，组织或细胞在特定条件，特定时间所表达的全部蛋白质图谱。 2.1 蛋白质组学定义 1994年，Marc Wilkim在Siena双向凝胶电泳(two—dimen．sional electrophoresis，2-DE)会议上最早提出了蛋白质组(proteome)概念是由一个基因组或一个细胞，组织表达的所有protein。 2.1.1蛋白质组 2.1.2 蛋白质组学（proteome) 2.2 蛋白质组学研究内容 2.2.1蛋白质鉴定： 分子量及等电点分析 western blot 或者免疫共沉淀等技术初步鉴定蛋白质种类 质谱技术分析蛋白质的氨基酸序列 在数据库中对比确定蛋白质的家族归属 2.2.2 蛋白质的修饰： 真核生物蛋白质翻译后会进行修饰：乙酰化 磷酸化 糖基化 这些修饰是调节蛋白质功能的重要方式 2.2.3 蛋白质功能确定： 研究蛋白质的功能，蛋白质相互作用 酵母杂交技术 噬菌体展示技术 RNA干扰技术 三、蛋白质组学研究技术 双向电泳技术(2—DE) 荧光差异显示双向电泳技术(2D—DIGE) 蛋白质质谱分析技术(ESI—MS) 1975 年,意大利生化学家O’Farrell （奥法雷尔）发明了双向电泳(2-DE)技术。该技术应用两个不同分离原理为依据进行分离，即利用蛋白质分子的等电点(PI)和相对分子量的不同进行分离．第一向电泳是蛋白质的等电聚焦，根据蛋白质等电点差异进行分离，该分离技术采用固定pH梯度技术(IPG)可以实现等电点只差0．01pH单位的蛋白质的分离；第二向电泳是利用蛋白质相对分子量差异进行分离，可分离相对分子量在100×103～150×103的蛋白质。 3.1 双向电泳技术(2—DE) 例如：番茄种子空间搭载与地面后代叶片的差异蛋白质组研究。CK-2是对照组，MIR-2是实验组。 图1用不同裂解液裂解后的CK-2双向电泳图 左图裂解液中的去垢剂用的是CHAPS,右图裂解液中的去垢剂是NP-40。 图2 对照样品CK以及和平号搭载样品MIR 的双向电泳结果图 样品MIR-2和对照组CK-2的双向电泳结果进行了IMAGE MASTER 软件分析, 共找到了42个表达差异2倍以上的蛋白质点,对其中26个差异比较明显的蛋白质点进行了ESIQ-TOF MS /MS质谱分析, 共鉴定出10个蛋白质点, 鉴定的蛋白质在对照组均表现为上调, 在空间站搭载样品中表现为下调。 3.2荧光差异显示双向电泳技术(2D—DIGE) 荧光差异显示凝胶电泳(2D-DIGE)是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术，比经典的2-DE 具有更高的动力学范围和灵敏性。该方法通过引入内标使得多个样品在一块胶上分离，进而减少了实验条件不一致引起的误差。DIGE 技术可检测到表达差异小于10％的蛋白，统计学可信度达到95％以上。 DIGE 系统基于荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术，是利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS凝胶图像。 DIGE 系统结合了新型荧光技术、样品多路技术(sample multiplexing)和图像分析等特有的技术，是一套优于经典的2-DE 的完整的系统。 DIGE的试验流程 3.3 蛋白质质谱分析技术(ESI—MS) 质谱分析技术是利用质谱仪使物质离子化成离子并通过适当的电场、