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酶解反应与膜分离耦合连续制备酪蛋白磷酸肽 主要内容 引言 引言 本文是将连续流动搅拌釜式-超滤膜（CSTR/UF）组合酶膜反应器应用于活性多肽的高效制备过程,考察操作变量对反应器性能和酶解反应转化率的影响规律；利用高效凝胶排阻色谱系统测定酶解物系相对分子质量分布；比较间歇与连续水解反应过程特性；并建立连续酶解反应动力学模型,为生物反应器的进一步工业放大提供理论基础。 1.材料与方法 1.材 料：酪蛋白 胰蛋白酶 甲醇 其他试剂（均为分析纯） 2.实验仪器：自动电位滴定仪 双光束紫外分光光度计 HPSEC系统：WDL-95色谱工作站, P200II型高 压恒流泵,UV-200II紫外可变波长检测器, 排阻色谱柱 中空纤维超滤膜 1.材料与方法 3.方法 ?连续酶解步骤与检测 在图1所示装置中进行连续酶解反应,维持体积、温度、pH、搅拌速率恒定,定时对截留液和渗流液取样检测。蛋白质含量测定采用标准蛋白紫外分光光度法；蛋白酶活性测定为F.I.P紫外分光光度法。 ?酶解产物色谱分析过程 将连续酶解工艺所得截留液与渗流液，用0.45m微孔滤膜过滤后,按如下HPSEC操作条件进行色谱分析：流动相为0.1mol/L，pH=7磷酸缓冲液；流速0.5mL/min；进样量20L；检测波长280nm；检测时间45min；柱温25。 ?停留时间分布函数实验测定 循环体系先以磷酸缓冲液做补液,待渗透通量稳定后,将补液迅速切换为已制得的多肽水解液(经6000Da中空纤维膜过滤),并连续检测280nm下渗流液的吸光度值变化。 1.材料与方法 2.理论分析 动力学模型推导如下：对连续酶解反应过程做如下简化与假设: ①近似认为超滤膜组件对胰蛋白酶及酪蛋白完全截留； ②酶解前经底物循环保护后可忽略膜组件对该酶的活性影响； ③酶解单元遵循单底物拟均相不可逆酶促反应动力学方程； ④酶解操作达稳态时因体积 V反应器》V中空纤维膜，渗透通量J循环》J渗流，故可认为CSTR/UF的动力学行为近似等效于CSTR； ⑤暂不考虑物质在膜上的传质行为。 2.理论分析 上式中,ρso为初始底物质量浓度，g/L；ρeo为初始酶质量浓度,g/L；r为酶解反应速率,mol/(L)min)；Km为米氏常数,g/L；kcat为酶转换数；X为酶解反应转化率；τ为修正空时。 3.结果与讨论 3.1 膜选择性研究 3.结果与讨论 3.2 操作变量对反应转化率X及反应器生产能力K的影响规律 X及K值可有效表征反应器的性能特点,是衡量连续水解工艺的重要参数。结果如图3和图4所示。 将ρso、ρeo、V、J4个参数归并为酶与底物质量浓度比(ρeo/ρso)以及平均停留时间t(V/J)二组合变量来描述反应器性能。图3中X随ρeo/ρso的增大以乘幂规律平缓上升,而K则大幅降低,连续酶解时,增加底物质量浓度可在一定范围内最大限度地利用蛋白酶,但底物转化率相对减小,而增加酶质量浓度将使同样数量的底物降解更彻底,转化率更高,但单位酶产量相对减少;图4中V、J二参数对X及K值作用相反,影响规律与t值密切相关,V增大或J减小都将使t增大,这意味着酶与底物有充分的混合接触时间而使X以指数规律提高,而K值定义式决定的反应器生产能力则随t增大而减小。 3.结果与讨论 3.结果与讨论 对各谱峰面积积分并修正计算后求得中空纤维膜对相对分子质量6000的目标多肽的表观截留率为71.23%。 由图可知: (1)稳态时渗流液与截留液均以相对分子质量相对较小的多肽为主,说明连续水解较之间歇酶解因消除了产物抑制等多种因素而使降解更彻底,转化率更高,有利于提高水解度； (2)超滤膜对体系中相对分子质量6000Da的原始底物与大肽有着较好的截留效果,同时酶解过程中不断形成的小肽也被及时排离,这既实现了反应与分离过程的集成,还可有效控制产物相对分子质量分布,为活性多肽的高效制备提供了一种很好的生产工艺模式。 3.结果与讨论 3.4 BSTR间歇水解与CSTR/UF连续水解比较 3.4.1动力学常数 由间歇及连续酶解反应L-B算图求得动力学常数列于表1。可见连续酶解过程Km值减小,kcat值增大,rmax值增大,说明底物酪蛋白与胰蛋白酶表观亲和力增强,酶促水解反应转换数增大,即单位时间内,胰蛋白酶活性中心能转化底物分子为产物的数目增多,酶解效率提高。 3.4.2反应转化率及反应器生产能力 与间歇反应器相比,酶膜反应分离