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2011-11-20 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：Octet RED System 在蛋白质相互作用动力学检测中的应用 试验人员：林齐帆、潘志针、朱育菁 试验负责：朱育菁、潘志针、林齐帆 报告日期：2011-11-20 计数月份：2011年11月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 05911．试验目的 Octet RED System 蛋白互相作用系统是应用专利的BLI（Bio-Layer Interferometry）技术，即生物膜层表面干涉技术进行精确检测。此技术用光纤制成的生物传感器底端覆盖了生物分子相容层，用来固定相互作用分子中的一个，形成生物膜层。相互作用发生时，生物层厚度增加，反射光干涉光谱曲线整体向波长增加方向移动。分子结合或解离时，都会导致干涉曲线的漂移。Octet RED System可进行定量分析（分子之间有无结合，结合的量有多少），动力学和亲和性分析，结合能力和结合的协同性（结合速率Ka，解离速率Kd，结合常数KD）等。它广泛地应用于抗原—抗体、蛋白质分子之间以及药物—蛋白质、受体—配体、DNA与蛋白质之间、核酸—核酸等相互作用的研究中。2010年，Eric Bourhis 等在JBC上发表了”Reconstitution of a Frizzled8-Wnt3a-LRP6 signaling complex reveals multiple Wnt and Dkk1 binding sites on LRP6”，其中hLRP6 和 mFz8 CRD-Fc 与 FA 及 AHC的结合动力学研究中就应用了Octet Red 技术。Octet Red 技术具有操作简单，分析速度快，准确度高（CV值10%），灵敏度高（可检测小至150Da的分子）等特点。它可以计算结合速率常数和解离速率常数等动力学常数。 2．实验器具及仪器 图1 如图1所示为Octet RED System 蛋白互相作用系统， 脱盐柱 2.2 实验原理 Octet RED System平台基于生物膜干涉技术，检测特异吸附的蛋白质间的相互作用，及其动力学分析。如图2所示，当一束可见光从光谱仪射出后，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱任何由于分子结合而形成的膜层厚度变化，能够通过干涉光谱的位移值而体现。 图2 图3 3 传感器的固化 Octet RED System平台基于蛋白质的特异性吸附检测，实验之初要将待检测的蛋白质1固定在sensor上。主要的固化方法有生物素-链霉亲和素（SA 传感器）直接偶联（最普遍的是胺基偶联，AR传感器）生物素-链霉亲和素（SA 传感器）: SA-sensor固化了链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基 生物素的标记以及标记的蛋白的固化不受环境影响，蛋白由于标记而失活的概率很低。在中性的pH与温和的环境中反应，生物素与蛋白的摩尔比最好比较低（理想的是1:1）生物素标记后需要用脱盐柱除去剩余的生物素试剂，生物素链霉亲和素非常稳定，可重复性好，而且易于保存。 3.2 直接偶联（最普遍的是胺基偶联，AR传感器）蛋白质的固化在酸性的pH 中进行(commonly pH 5); 一般需要对pH进行优化。容易导致蛋白失很多偶联试剂需要新鲜配制，而且需要加入封闭步骤（乙醇胺） 生物素化 胺基偶联 过程优化 几乎不需要，固化浓度偶尔需要优化 一定需要优化pH和固化浓度 批量制备 非常简单，只需要一步结合 比较困难，需要有活化和封闭 空间位阻 通过不同的生物素化试剂可以加入不同的linker 无法克服 保持蛋白稳定性 固化条件温和，容易保存 酸性条件固化，蛋白容易受影响 蛋