测序技术.doc.doc

　快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义，而获取遗传信息的主要手段之一是测序技术，因而测序技术在生命科学研究中扮演了重要的角色。 　　在此报告中主要介绍2个部分的内容：一、测序技术的发展，包括第一、二、三代测序技术（Sanger测序、高通量测序、单分子测序）；二、个人化基因组测序仪PGM，主要介绍它的原理、特点、流程及应用。 ? ? ? ?? ? 　　　本图所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。测序技术最早可以追溯20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。但是直到1977年 Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，才标志着第一代测序技术的诞生。此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，主要包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。最近，Helicos公司的单分子测序技术、Pacific Biosciences公司的单分子实时测序技术(Single Molecule Real Time, S M R T )和 Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术的主要代表。而Ion Torrent的PGM由于其独特的测序方式被认为是第2.5代测序技术。 ? ? ? ? 　　第一代测序技术--双脱氧核苷酸末端终止测序法（又称为sanger测序法）是Sanger在1977年发明的技术。其原理是：核酸链的延伸是由于dNTP可以在5′磷酸基团和3′羟基形成磷酸二酯键，当核酸链插入一个2′和3′都不含羟基的ddNTP后，在下游的DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。此后，在Sanger法的基础上，80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。尽管第一代测序技术有其优点：测序准确、读长长，而且在噬菌体基因组测序和人类基因组计划项目上大展身手，但是由于成本高、速度慢、通量低，已不能满足科学家对测序的需求。 ? ? ? ? 　　故业界催生了第二代测序技术—高通量测序技术（又称为深度测序）。它以通量高和速度快为主要特点。这里将主流的第二代测序平台（Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa和ABI公司的Solid技术平台）的原理和流程做一简单的介绍：由于第二代的读长相对较短，所以针对比较长的核酸序列如基因组DNA，就需要使用不同手段（如：超声、酶切、喷雾等）将其处理成合适长度的片段；将其补平和标签化，然后采用每个平台独特的扩增技术将核酸片段大量扩增：454、Solid以及Ion采用的是乳液PCR，Solexa采用的是桥式PCR；第二代测序平台的另外的每个平台的独特之处是测序的检测手段：454采用焦磷酸测序，一个磁珠等于一条读长；Solid采用连接酶测序，Solexa使用的是可逆末端终止反应，Ion采用的是H离子检测。与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。例如：使用第一代Sanger的测序技术完成的人类基因组计划，花费了30亿美元巨资，用了三年的时间；使用第二代SOLiD的测序技术，完成一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。但是第二代测序技术也有其短板：测序读长较短，不利于后续生物信息学分析；同时由于采用的是PCR技术，存在扩增效率不一致的现象，对于表达分析会有影响。 ? ? ? ? 　　目前正在研发的第三代测序技术，最大的特点是单分子测序，不需要对核酸片段进行扩增，直接对其进行测序。其中，Heliscope技术和SMRT技术都基于边合成边测序的的思想，利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术使用核酸外切酶测序，利用切下来的不同碱基产生的电信号不同进行测序。虽然第三代测序有许多优点如直接、快速、无扩增、读长长等，但是由于技术不成熟，存在错误率高，可靠性差的不足，有待于进一步的改进。 ? ? ? ? 　　总结一下各代测序技术的特点。对于某一种测序技术来讲，测序成本、读取长度和测序通量是评价测序技术先进与否的重要标准。第一代测序技术：虽然读长长，但是单碱基测序成本高，通量低；第二代测序技术：也是基于边合成边测序，但是它的通量大为提高，测序成本也得以降低，不完美的地方在于需要