融合基因anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)-中国细胞生物学学报.doc

融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的构建 及真核表达 隋文君, 苏世振, 胡望雄, 李红智*, 布立敬 (温州医学院浙江省重点医学遗传学实验室, 温州325035) 摘要 利用SMODEL预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR的方法分别从重组pPIC9k、重组pBullet和pSecTag2B上扩增出3段基因片段，即片段anti-erbB2-scFv(简称A)、片段Fc-CD28-CD3(ζ)(简称B)和信号肽序列(简称S)。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段S-A-B。经TA克隆扩增及鉴定后，将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体，电转染人淋巴瘤T细胞株Jurkat，G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。经预测在anti-erbB2 scFv与Fc基因片段之间不加连接肽的融合蛋白，在三级结构上可形成更佳的功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/S-A-B(在A与B基因片段之间不加linker)。经流式细胞术检测，在转染的Jurkat细胞中融合蛋白表达率约为56.17%。应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)，融合基因能够在淋巴瘤T细胞株中表达，为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞，进行erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础。 关键词 erbB2; 融合基因; 表达载体; 肿瘤治疗 HER2/c-erbB-2是编码一种生长因子受体(HER2/c-erbB-2受体)的癌基因。HER2作为一种重要的肿瘤相关抗原，在肿瘤靶向治疗中倍受关注[1]。目前，在以HER2为靶向/靶点的抗肿瘤治疗研究中，以单克隆抗体Herceptin应用最为广泛。但对Herceptin进行的临床实验证明，其有效率较低。 本实验应用基因工程的方法对抗erbB2单链抗体可变区基因(scFv)进行改造，构建融合基因anti-erbB2-scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)，不仅保留抗原结合特异性，增加抗体Fc段使其接近全抗体的效果，并引入CD28的跨膜区使其成为T细胞膜表面锚定型抗体，引入CD3的ζ链充分激活T细胞的抗肿瘤活性。本实验所构建的含anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-ζ融合基因的T细胞能够同时发挥体液免疫和细胞免疫的双重作用来产生免疫应答从而彻底清除肿瘤细胞。 1材料与方法 1.1 材料 1.1.1 载体和质粒 pMD19 Simple T购自大连宝生物公司，pLNCX购自杭州远方生物公司，含Fc-CD28-ζ的重组pBullet由温州医学院俞康教授赠予，含anti-erbB2 scFv的重组pPIC9k由中国科技大学刘兢教授赠予，pSecTag2B购自Invitrogen。 1.1.2 细胞株 人急性淋巴瘤T细胞株Jurkat购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。 1.1.3 培养基(液) LB培养基和RPMI1640培养液购自上海生工，FBS购自杭州四季青生物工程公司。 1.1.4 主要试剂 Ex Taq酶、Pyrobest Taq酶、Hind Ⅲ、ClaⅠ和T4连接酶均购自大连宝生物公司，PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒和G418均购自上海生工，Lipofectin 2000购自Invitrogen，anti-human IgG FITC和Mouse IgG1 FITC购自BD公司。 1.2方法 1.2.1 融合基因的蛋白表达结构预测 已知融合基因各片段DNA标准序列便可利用MODEL预测该融合蛋白膜外区的三级结构。通过比较三级结构，评估两种连接方式(scFv与Fc之间加连接肽或不加连接肽)的优缺点。 1.2.2 pSecTag2B、重组pPIC9K和重组pBullet的转化、筛选、提取及电泳鉴定 1.2.3 3段目的基因片段的获取及融合基因的构建根据已知的signal简称S、anti-erbB2-scFv简称A、Fc-CD28-CD3ζ)(简称B3段目的基因片段的DNA序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo6.0设计普通PCR及SOE-PCR引物表1，引物由上海生工合成。Table 1 Primers for amplifying three gene fragments (regular PCR and SOE-PCR, 5’-3’) Fragments Primers Tm (℃) S A B SF：GCT GGA AGC TTA GCA TGG AGA CAG ACA CAC SR：GTC AGC ACA ATG TC