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验证方案 项目名称：暑湿感冒颗粒微生物限度检查方法验证 验证小组成员： 部门 质量部 质量部 质量部 质量部 姓名 高怀中 张明雄 杨平 陈茜羽 职位 质量部经理 QC主管 QC人员 QC人员 目录 验证目的…………………………………………………………….3 方法简介…………………………………………………………….3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证…………………………….4 控制菌检验方法的验证…………………………………………….5 5. 附录………………………………………………………………….6 1.验证目的 通过暑湿感冒颗粒微生物限度检查的验证，确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。 2.方法简介 因本品含挥发油，为快速建立有效的微生物限度检查方法，我们直接采用薄膜过滤法进行细菌计数检查和控制菌检查，采用常规法进行霉菌和酵母菌计数检查。根据验证结果判断是否符合验证要求。若符合，暑湿感冒颗粒按验证的方法和条件进行微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证要求。 3.细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 3.1样品：暑湿感冒颗粒，批号： 130301 3.2菌种及来源 大肠埃希菌[CMCC（B）44 102 ] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 黑曲霉菌[CMCC（F）98 003] 来源为四川省食品药品检验所，自行传至所需代数 3.3菌液的制备 3.3.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤或者营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时。取上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释制成每1ml含菌数50～100cfu工作菌液，并采用营养琼脂培养基计数。 3.3.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48小时。取上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释制成每1ml含菌数50～100cfu的工作菌液，采用改良马丁琼脂培养基计数。 3.3.3接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天至大量孢子产生，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，用玻棒或白金饵轻轻振摇将孢子洗脱，然后，用无菌移液管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含菌数50～100cfu工作菌液，采用改良马丁琼脂培养基计数。 3.4细菌验证试验（薄膜过滤法800ml） 3.4.1供试液的制备 取供试品10g至乳钵中，研细，加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml混匀，500转/分低速离心5分钟，迅速取上清液1ml加至5mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，摇匀，作为1:50供试品溶液。 3.4.2试验组 取1:50供试品溶液1ml加至100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，按薄膜过滤法操作，过滤后滤膜用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分8次冲洗每次100ml，在最后一次冲洗液中分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的工作菌液（50～100cfu）1ml，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上，立即倾入冷却至45℃左右的培养基。每株试验菌平行制备2个平板，于规定温度培养3天后观察结果计数。 3.4.3活菌组 测定每一菌株每1ml的试验菌数。分别取试验菌1ml于100 mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，薄膜过滤，过滤后，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上，立即倾入冷却至45℃左右的培养基。每株试验菌平行制备2个平板，于规定温度培养3天后观察结果计数。 3.4.4供试品对照组 测定供试品本底菌数。取1:50供试品溶液1ml加至100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，按薄膜过滤法操作，过滤后，滤膜用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分8次冲洗每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上，立即倾入冷却至45℃左右的培养基。于规定温度培养3天后观察结果计数。 3.4.5 稀释剂试验组：采用稀释液替代供试液，按试验组薄膜过滤法操作，进行菌落计数。 3.4.6:稀释剂对照组；采用稀释液替代供试液，按试验组薄膜过滤法操作，不加试验菌，进行菌落计数。 3.4.7回收率测定结果 试验组菌回收率=【（试验组菌数-供试液对照组菌数）/活菌组菌数】×100% 稀释剂对照组菌回收率=【（稀释液试验组菌数-稀释液本底菌数）/活菌组菌数】*100%