生物化学2蛋白质(环境)教材.ppt

5） 找重叠肽从而推断出整个肽链的氨基酸序列 如: N-末端残基H C-末端残基S 第一套肽段:OUS,PS,EOVE,RLA,HOWT 第二套肽段:SEO,WTOU,VERL,APS,HO 借助重叠肽确定肽段次序: 末端残基: H S 末端肽段: HOWT OUS APS 第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全序列 HOWTOUSEOVERLAPS 6 ） 二硫键位置的确定 对角线电泳法: 先用胃蛋白酶水解,分成小肽,点样在滤纸中央,进行第一向电泳,电泳完毕,将滤纸暴露在过甲酸蒸汽中,使S-S键断裂,转90°,进行第二向电泳,不在对角线上的为S所在位置 1） 蛋白质分子的可解离基团 2） 等电点 在一定pH条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质带电。在酸性情况下，蛋白质中的各碱性基团接受质子，使蛋白质带正电荷；在碱性情况下，蛋白质中的各酸性基团解离出质子，使蛋白质带负电荷。在某一pH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的pH值就是蛋白质的等电点。 （1）蛋白质的两性电离及等电点 每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。 蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系: 等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。 ３.电泳 移动的速度 v = E · Z f 四、蛋白质的性质与分离、分析技术 概念：变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失。 理论：吴宪提出 肽链从紧密有序结构→松散无序的结构 （2）蛋白质的变性 1）变性的因素 物理因素: 加热、紫外线、X-射线、超声波等。 化学因素: 酸：等电点 碱：等电点 有机溶剂：破坏水化层 蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）：争夺氢键 重金属盐：形成盐沉淀。 2）变性蛋白质的特性 生物活性全部或部分丧失 一些侧链基团暴露，可滴定基团增加 一些物理化学性质的改变 生化性质的改变 3）变性的可逆性 巯基乙醇：HOCH2CH2SH 尿素： 蛋白质的一级结构决定高级结构 4)凝固作用 变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固。 由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。 蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。 （3）蛋白质的胶体性质 １）加酸沉淀蛋白质 ：蛋白质等电点多偏酸，加酸使达到蛋白质等电点；或者和蛋白质形成不溶解的盐。 ２）加中性盐沉淀蛋白质 ：盐析（加大量高浓度中性盐，蛋白质沉淀） 盐溶（加少量低浓度中性盐，溶解度增加） ３）加有机溶剂沉淀蛋白质 ：如乙醇，能破坏水化层。 ４）加重金属盐沉淀蛋白质：蛋白质碱性溶液带负电，可与重金属盐 产生沉淀。 ５）加生物碱试剂沉淀蛋白质：与蛋白质生成溶解度很小的盐类。 （4）蛋白质的沉淀反应 反应名称 试 剂 颜色 反应有关基团 有此反应的蛋白质或氨基酸 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫色或粉红色 二个以上肽键 所有蛋白质 米伦反应 HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物 红色 ? Tyr 黄色反应 浓HNO3及NH3 黄色、橘色 ? Tyr、Phe 乙醛酸反应 (Hopking-Cole反应) 乙醛酸试剂及浓H2SO4 紫色 ? Trp 坂口反应 (Sakaguchi反应) α-萘酚、NaClO 红色 胍基 Arg 酚试剂反应 (Folin-Cioculteu反应) 碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基、吲哚基 Tyr 茚三