平成18年度セアカゴケグモ毒性试験报告书.doc

平成18 年度セアカゴケグモ毒性試験報告書 大阪府健康福祉部環境衛生課 大阪府立公衆衛生研究所 【目 的】 セアカゴケグモ発見から10 年が経過した現在、その棲息地域は大阪府内をはじめ近畿全域に拡大しつつあり、また、咬傷事故報告数も増加している。そこで今回は、1）大阪府内に棲息するセアカゴケグモの毒性が日本で繁殖を繰り返す中で、10 年前と変化しているかどうかを検討することを主目的とし、さらに2）老齢および幼齢マウスに対するクモ毒の影響を若年マウスに対するものと比較検討すること、3) 再度クモに咬まれた場合を想定して、毒腺液を再投与された個体の毒性症状を検討することを目的として毒性試験を実施した。 材料と方法 今回の実験における毒腺液の調整およびマウスへの毒腺投与は、1996?97 年に実施したセアカゴケグモ毒性試験の方法に準じて行った。詳細は以下の通りである。 （毒腺の摘出および毒腺液の調整） 大阪府内南部で採取されたクモから摘出した毒腺を滅菌リン酸緩衝液中（PBS）にストックし、毒性試験直前まで?135℃で冷凍保存した。マウスに投与する毒腺液は、滅菌リン酸緩衝液で毒クモ0.33 匹分、0.25 匹分、0.125 匹分、0.1 匹分の濃度に希釈して用いた。毒腺液を段階的に希釈して投与する理由としては、一般的に毒を有する昆虫（クモも含む）では、通常1 回の咬傷で保有する全毒腺量を注入することは無いことと、また同時に毒腺液の半数致死量値（LD50 値）注1 を算出するためである。投与した毒腺液の蛋白量は、市販の蛋白量測定キット(Coomassie Protein Assay Reagent Kit/PIERCE, USA)により測定した。 （使用マウス） 生殖年齢に達した若年マウス（ddy Slc: 8 週齢／雄：人間の青年に相当）、老齢マウス（ddySlc: 20 ヶ月齢／雌：老年に相当）および乳離れ直後の幼齢マウス（ddy Slc: 4 週齢／雄：幼児に相当）を用いた（なおマウスの平均寿命は24 ヶ月である）。 （実験方法） １）若年マウスを用いた毒性試験 (1) 初回投与実験 毒性試験には各群10 匹のマウスを用い、独立した2 回の実験を実施した。毒腺液の接種は、マウス1 匹あたりそれぞれ毒クモ0.33 匹分、0.25 匹分、0.125 匹分、0.1 匹分の毒腺液および、陰性対照として滅菌リン酸緩衝液(PBS) を腹腔内投与した。投与後、症状、生死を6?7 日間観察した。また中毒症状の程度を推定する指標として、期間中の各マウスの体重の増減を測定し、さら毒腺投与群での生存マウスの平均体重減少率注2 を算出した。 (2) 再投与実験 初回の毒性試験で生存した個体について、1 ヶ月後に同様の実験を繰り返し同様の観察を行った。なおこの実験については1 回のみ実施した。 ２）老齢マウスを用いた毒性試験 老齢マウスについては、5 匹および4 匹の2 群にそれぞれ毒クモ0.33 匹分、0.25 匹分の毒腺液を腹腔内投与して、症状、生死および体重を7 日間観察した。 ３）幼齢マウスを用いた毒性試験 (1) 初回投与実験 各群10 匹のマウスを用いた。毒腺液の接種は、マウス1 匹あたりそれぞれ毒クモ0.33 匹分、0.25 匹分、0.125 匹分、0.1 匹分の毒腺液および、陰性対照として滅菌リン酸緩衝液(PBS)を腹腔内投与した。投与後、症状、生死および体重を7 日間観察した。独立した2 回の実験を実施し、死亡率および体重減少率を比較した。 (2) 再投与実験 初回の毒性試験で生存した個体について、1 ヶ月後に同様の実験を繰り返し同様の観察を行った。この実験においても独立した2 回の実験を実施した。 4）半数致死量値(LD50 値)の算定 投与したクモの各希釈毒腺液蛋白量には幅があり、毒腺希釈率とその死亡率の比較だけでは毒性の比較には不十分である。そこで毒性比較の指標として、各試験における毒腺液蛋白質量と死亡率に基づき、Microsoft Excel を用いて2 次曲線グラフを作成して算定した。 結果 1）若年マウスを用いた毒性試験 (1)毒腺液初回投与実験 毒腺液を投与されたマウスは、投与後約30 分から立毛、痙攣、歩行困難などの中毒症状を現し、毒液の蛋白質濃度が高いマウス群では、次第に衰弱し死亡する個体が見られた。2回の独立した実験結果を平均した、各投与群の死亡率と体重減少率を表1 に示した。投与毒腺液の蛋白量にもとづいたLD50 値は0.88mg/kg であった。毒腺投与群の平均体重は投与後1 日目から著しく減少を始め、症状が回復する過程で増加した。しかし0.33 匹および0.25 匹分の毒腺液を投与した群では、