大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究概要.docVIP

大实验 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。 实验原理及相关知识 蔗糖酶的介绍 自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的(—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 （2）。实验原理： 本实验提取面包酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 名称 MW 糖含量 亚基 底物为蔗糖的 Km 底物为棉子糖的Km 等电点 pI 最适 pH 稳定 pH 范围 最适温度 外酶 27万(22万) 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9(3.5～5.5) 3.0～7.5 60℃ 内酶 13.5万 ＜3% 双 25mM 150 mM 4.5(3.5 ～5.5) 6.0～9.0 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖）的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 本实验共有以下分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 （一） 蔗糖酶的提取与部分纯化： 一、实验目的：学习酶的纯化方法。 二、试剂： 面包酵母 二氧化硅 蒸馏水（使用前冷至4℃左右） 冰盐浴 1N乙酸 95%乙醇 四、操作步骤： 1. 提取 （1）称取5g干酵母，称10g二氧化硅，放入研钵中。 （2）量取预冷的蒸馏水30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时可以用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 （3）将混合物转入离心管中，平衡后，用离心机离心，4000rpm，30min。如果上层白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层脂肪层弃去。 （4）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，注意不要取沉淀，将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。 （8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。 2. 热处理 （1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4000rpm，离心30min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。 3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。4000rpm，离心30min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。 废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。 4.酶活力的测定 利用旋光仪进行操作，一致的位置，再从度盘上读数。读数是正的为右旋物质，读数是负的为左旋物质。将旋光仪接于220V交流电源。开启电源开关，约5分钟后钠光灯发光正常，就可开始工作。 (2)检查旋光仪零位是否准确，即在旋光仪未放试管或放进充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是否一致。如不一致，说明有零位误差，应在测量读数中减去或加上该