浅析蛋白质相互作用的技术方法及其研究进展[综述].docVIP

浅析蛋白质相互作用的技术方法及其研究进展 张君艳 (河北农业大学现代科技学 院生物技术0903班，河北 保定 071000) 摘要：蛋白质与蛋白质的相互作用,人们能更好地注释蛋白质的功能,解码生命现象,特别是在新药物的设计上具有极大的实用价值,这是后基因组研究的重要任务之一。本文主要阐述了酵母双杂交技术、蛋白质芯片技术、噬菌体展示技术、免疫共沉淀技术、串联亲和纯化技术、GST-pull-down技术的原理和研究进展。 关键词：酵母双杂交技术；蛋白质芯片技术；噬菌体展示技术；免疫共沉淀技术；串联亲和纯化技术；GST-pull-down技术 引言 随着蛋白质研究的逐步深入人们对蛋白质与蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI) 的研究也越来越引起广泛兴趣[1]。Field和Song首先提出酵母双杂交系统，这是一种直接于酵母细胞内检测蛋白质之间互相作用的新方法，可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因[2]。该技术以其简便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点得到广泛应用[3]。 真核细胞基因转录激活因子的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域(binding domain,BD)和转录活化结构域(activation domain,AD)共同完成的[4]，这两个结构域通过共价或非共价连接建立的空间联系是导致结合和激活发生的关键[5,6]。根据这一特点,如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成杂合蛋白的形式在酵母中表达并分布干细胞核中，X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整休而与报告基因的上游激活序列(upstream activation sequence)结合，进而发挥激活转录的功能,使受调控的报告基因得以表达。根据这一原理,双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。 作为一种高度敏感[7]、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白质在体研究体系,双杂交系统主要应用于：①验证通过其他方法发现的蛋白质间可能的相互作用②确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸③筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质。由于具有相对简便、快速及不经蛋白质纯化即可直接获得编码基因的特点，采用双杂交体系从cDNA文库和基因组文库中直接筛选出蛋白质间相互作用成为它最具优势之处。由此而鉴定的各种受体、转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及参与细胞周期调控、肿瘤发生的蛋白质已不胜枚举[8~12]。 2 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜、载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描等技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质[13]之间相互作用的关系，从而达到测定各种蛋白质功能的目的。从德国科学家Lueking等[14]最早开始研究至MacBeath等[15]成功制备了10800点的蛋白质微阵列,蛋白质芯片已走出基因微阵列的阴影，获得巨大的发展。归纳起来,蛋白质芯片主要有以下优点[16,17]：(1)蛋白质芯片上可以实现成千上万个蛋白质样品的高通量平行分析。(2)高的信噪比。(3)所需样品量极少,检测水平已达ng级。(4)在基因组和蛋白质组水平将DNA序列信息与蛋白质产物直接联系起来。 3 噬菌体展示技术 噬菌体（Bacteriophage）是一系列具有感染原核细胞以完成自身复制的病毒。基于其基因和结构的单一性，噬菌体自被发现以来便广泛服务于生命科学领域[18]。噬菌体展示技术(Phage display)是在噬菌体颗粒表面表达外源性多肽，从而获得能与配体结合的特异性分子表位。具体方法是将外源 DNA插入编码噬菌体衣壳蛋白的基因组中并表达，使目的多肽片段与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白， 分布在噬菌体表面。在此过程中衣壳蛋白只是发挥对展示肽段的锚定作用，而对其结构无影响；反之，外源多肽的表达同样不干扰噬菌体感染和扩增的能力。最终实现了特异性分子在同一噬菌体颗粒内基因型与表型的统一。以此为基础，结合基因重组技术，可收集大量由噬菌体展示的 cDNA 编码蛋白或多肽从而构建噬菌体展示文库。再采用与固定配体相互作用的亲和筛选方法, 可以富集得到能表达某种特异肽序列的噬菌体。 4 免疫共沉淀技术 免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation,Co-ip)发展较早，是用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质间的相互作用[19]。该技术运用特异性抗体与蛋白特异性结合的原理，通常是蛋白或其复