人胚胎肾HEK293细胞无血清培养.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四班全国发酵工程学术甘话套论文辜 人胚胎肾(HEK)293细胞无血清培养 陈春艳，易小萍，孙祥明．张元兴 (华东理工大学生物反应工程国家重点实验室，上海200237) 摘要：本文开发了一种适合HEK．293细胞高密度生长的无氨低乳豉的廉价无血清培养 293 基(HEKSFMC)．在该无血清培养基中培养HEK．293细胞，培养第5天时，最大细胞 密度可达到3．8×106eells／ml。 前 言 人胚胎肾(HEK293)细胞首先由Graham等在1977年建立“]。HEK293细胞能够 复制必需序列。因此，缺失了E1A基因和E1B基因的腺病毒Ad5能在HEK293细胞中 繁殖，而不能在其他细胞内复制。这样HEK293细胞就成了基因治疗用重组腺病毒生 产的理想宿主。利用表达特异性蛋白的重组腺病毒治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗 传疾病已取得了可喜的进展，并已开始获准临床应用}利用腺病毒载体在HEK293细胞 中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸激酶1c、口一半乳糖甘酶、蛋白酪氨酸磷酸酶等，也是 重组蛋白生产的一条途径。此外，HEK293细胞还广泛用于瞬时基因表达生产重组蛋 白，进行药物筛选和临床前的评价试验。传统的HEK293细胞培养是有血清培养，但其 具有成本高、成分不明确、不利于下游产品的纯化、对细胞具有潜在毒性以及可能含有病 原菌等缺点口‘3]。近年来，人们越来越意识到动物血清对生产过程甚至最终产品存在的 潜在污染可能性，以及对于生物制品的安全性影响。无血清培养克服了有血清培养的诸 多缺点，因此，开发无血清培养基对生物制品的生产过程具有重要意义。 1材料与方法 1．1试验材料 HEK 293细胞(上海三维生物技术有限公司提供)，DMEM(GIBCOBRL)，胎牛血清 293 FBS(JRH)，HEK 微量元素、氨基酸及硫酸葡聚糖等成分。摇床(型号：TZ-03，ShenergyBiocolor)，尿素氮测 定试剂盒(上海生物制品研究所)，乳酸脱氢酶分析试剂盒(南京建成生物制品研究所)。 1．2细胞培养 ml 有血清细胞培养时，在T一25的方瓶中加入细胞密度为3×105cells／ml的10 第四次垒国发酵工程学术讨论会 反复轻轻吹打成单细胞悬浮液，以1：3传代，置于37℃、5％C02培养箱中培养。无血清 细胞培养时．在T-25的方瓶中加入细胞密度为3×105cells／ml的20ml自制的无血清培 cells／ml后，用移液管反复轻轻吹打成单细胞悬浮液，以 养基，待细胞密度达到约1×106 1：3传代，置于36．5C．5％co：培养箱中的摇床上培养，摇床的转速为120r／rain。 1．3分析方法与数据计算 用血球计数板点样计数细胞，每个样品计数3次，取平均值，用台盼蓝拒染法确定细 胞的存活率。 HEK293细胞在对数生长期的比生长速率： p“1 (1) 4兰1n(x～+。／xk) 其中“为细胞比生长速率，d～，t为时间，h；x为活细胞密度，cells／mL。 代谢副产物的净生成量(retool／L)： 岛。P～+．一气 (2) 代谢副产物(乳酸和氨)的比生成速率： ‰一妾案。≤氍意b ㈣ 其中q“。为代谢副产物的比生成速率，mmol／cell／d；P为代谢副产物浓度，mmol／L。 2结果与讨论 2．1 HEK