人血小板的冷冻干燥保存糖的浓度和种类的影响.pdfVIP

第^届全国冷冻-T-燥掌术交流会 2005年11月25—26日中国上海 人血小板的冷冻干燥保存…糖的浓度和种类的影响 周新丽1祝宏2张绍志1朱发明2陈光明1严力行2 (1浙江大学制冷与低温研究所低温生物实验室，杭州，310027；2浙江省血液中心，杭州 310006) 摘要：冷冻干燥法是使血小板能够I垂期保存的一种理想方法。本文以海藻糖、蔗糖、麦芽糖、 乳糖、葡萄糖作为冻干血小板的保护剂，研究糖的浓度和种类对血小板冻于保存的影响。冻 于保存血小板的效果用复水后形态学观察、凝血酶聚集实验、血小板回收率、膜联蛋白 (annexin)V活化分析四种方法进行综合评价。实验结果表明冻干保存30天后复水的衄小 板形态完整，对1U／ml凝血酶的聚集百分比为95．911．5％。根据冻干复水后血小板的数值恢 复率和恢复血小板中非活化血小板的百分比，计算冻千保存的非活化血小板的恢复率。非活 化血小板的恢复率随海藻糖浓度的增加而增加，当海藻糖浓度增加到20％时，非活化血小 板的恢复率达到85．7±3．4％。对于浓度均为20％不同种类的糖保护剂，非活化血小板的恢复 率由高到底的顺序为：麦芽糖)．葡萄糖，海藻糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖得到非活化血小扳的恢复 率最高，达到87．5±4．8％。 关键词：血小板冷冻干燥糖 1引言 目前的血站主要采用22℃振荡保存浓缩血小板，此条件下保存的血小扳由于活性的丧 失和微生物的污染，按照国家标准最多只能保存5天，这在临床应用中会产生供应不足和浪 费的问题。用DMSO溶液做低温保护剂，在．．8012或．4964C低温保存血小板可以延长保存期 限，但这种方法保存的血小板融解后只有30．40％的恢复率，并且融解后的血小板必须进行 洗涤以除去对人体有潜在伤害的EMSO，这会造成进一步的洗涤损失。冷冻干燥法为血小 板的长期保存提供了一种理想的方法。它是将浓缩血小板在低温下冻结，然后在真空条件下 使其中的水分升华、解吸而获得干燥血小板的一种技术。与低温保存方法相比，冷冻干燥法 保存血小板具有明显的优势：(1)冻干的血小板能够在环境温度下长时间稳定储存．不需要 任何低温设备；(2)冻干的血小板能够在使用时直接复水而恢复活性，适于应对紧急lP血情 况；(3)冻千的血小板质量大大减轻，便于运输。 早在1956年，I(1ein等【l】就首次尝试以冻干的形式保存血小板，但并没有得到满意的结 果。冻干的血小板没有保持结构的完整性，输注给血小板缺乏症的患者或动物后，也没有表 现出足够的止血作用。直到1995年。Read等例用多聚甲醛固定的方法提高血小板在冻干过 程中的渗透稳定性。从人血中分离出的血小板洗涤后用多聚甲醛固定，在含人血清白蛋白的 柠檬酸缓冲液中冻干，冻千后储存在．80℃。冻干复水后的血小板超微结构保存完整，能够 附着于动物模型内皮之下并在其表面传播。但是这种方法的主要缺点是多聚甲醛与细胞膜和 蛋白质会发生不可逆的交联作用，改变血小板的化学结构，削弱正常的止血作用并导致免疫 反应。2001年，WolIer等p1通过液相内吞作用将不可渗透的海藻糖载入血小板内部，以海 藻糖和人血清白蛋白作冻干保护剂成功地冻干了人血小板。复水后血小板的恢复率达85％， 对血小板聚集剂的收缩反应与新鲜血小扳几乎相同，傅立叶变换红外光谱学分析表明冻于复 水后血小板的膜以及膜蛋白成分与新鲜血小板相似。目前，Wolkers等【41已经将冻干血小板 浓度提高到lxl(Y9血小板／ml，体积扩大到m库中标准血袋的单位，冻干的血小板在室温F 第／、届全国冷冻干燥学术交流会 2005年11月25—26日中雹上海 至少稳定保存两年。 虽然血小扳的冻干保存已经取得了一定的成功，但是为了能够得到更高的存活率以适应 于临床应用，仍需要对其保存方案进行优化。影响血小板冻干保存效果的因素很多，例如保 护剂系统、冻干过程参数(降温速率、干燥温度和压力)、复水条件等。相比之下，保护剂 系统对血小板冻干保存效果的影响最为突出。糖类物质由于具有替代水分子以及形成玻璃态 的能力，在冻结和干燥过程中对细胞膜有很好的保护作用，已经成为药品、食品和生物体冻 干保存常用的保护剂之一[5-71。特别是非还原性双糖海藻糖和蔗糖，在蛋白质、脂质体、原 核细胞等生物系统的冻干保存过程中表现出突出的保护作用【8‘1“。因此，本文选