人脐带血全血冷冻干燥保存的初步研究.pdfVIP

第／＼届全国冷冻干燥学术交冻会 2005年11月25—26日中国上海 人脐带血全血冷冻干燥保存的初步研究 习德成 陶乐仁李军华泽钊陈迪张喻 (上海理工大学低温生物医学技术研究所军工路516号200093) 摘要：脐带血是一重要的造血干魍细胞(HSPC)来源，有着极为广泛的应用前景。本文将 脐带血全血预冻到～40℃后．一次干燥搁板温度控制在一30℃，二次干燥搁板温度控制在+15 ℃进行冻干。脐带血中冻干保护剂是以聚乙烯毗略烷酮，蔗糖，海藻糖和甘露醇等的不同组 合，比较了10种不同组份保护剂下冻干全血中有核细胞的恢复率，得出恢复率最高 合的保护效果，并比较了细胞冻千前后的形态，然后将样本在常温下放置三周后进彳一了PI 染色活性检测(89．08％)。 关键词：人脐带血冷冻干燥冻干保护剂活性检测 1引言 脐带血是指新生几脐带在被结扎后胎盘内由脐带流出的血。它数量较少(60一lOOtrd)。 但含有大量未成熟的造血干细胞。早在1974年，Kundtzon等人{1J就发现人脐带血中有较晚 期的造血祖细胞，大约10年后，Ogawa及其同事又发现人脐带血中有较原始的造血祖细胞： 1988年Gluckman等同首先在法国巴黎进行人类脐带血移植获得了成功．从此脐带血干细胞 研究和应用在全球得到了空前的发展。 目煎，脐带血的保存采用的是低温冻存的方式。雕深低温冰箱一86℃)保存只能用于 短期冻存，长久保存采用的方式是用程序降温后投入液氮中保存。用液氮保存，液氮消耗量 较大，需要～个定期自动灌注液氮的系统以补充液氮的损耗，而且建立脐血库以及维持它营 运的费用也比较昂贵。脐带血的保存迫切需要一种费用低廉、可行有效的方法。将冷冻干燥 技术用于生物细胞的保存具有无可比拟的优越性，制品在真空的环境下升华干燥后体积、形 状基本不变，呈海绵状，无干缩；复水时能够迅速还原成原来的性状；能够除去物料中90 ％以上的水分，真空密封后能在常温下长期保存，不需要昂贵的低温储存设备及复杂的保存 条件；而且冻干后质量很轻方便长途运输……因此，用冻干的方法保存血液细胞成为目前众 保存研究，到目前为止红细胞冻干复水后的存活率也没有超过50％。脐带血的冻干保存肖 红海阿等首次对脐血中分离的有核细胞进行了初步的实验研究，测得有核细胞存活率为 55．67％。 本文考虑到对脐血的分离会造成有核细胞的大量流失，对脐带血全血的冻干进行了初步 的探讨。实验中以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、海藻糖等为冻千剂进行冻干实验，通过改变脐 带血中冻干保护剂组分及浓度，比较冷冻干燥后全血中有核细胞的恢复率，并将样本在常温 下放置三周后进行了PI染色活性检测。 2材料与方法 上海市教委发展基金曙光计划项目 61 第^届全国冷冻干燥掌术交流会 2005年11月25—26目中国上海 2．1实验样本材料 试样为正常孕妇顺产的新生儿脐带血，采集容器用lOOml的无菌玻璃试剖瓶，内含月卡素 常温下最大存放时间不超过24小时。 2．2实验试剂 冻于保护剂：非渗透型的低温保护剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮，化学纯试剂，分子量约 10000～70000，广东汕头新宁化工厂进口分装)，蔗糖(分析纯，分子量342，3，上海华东师 限公司)，甘露醇(生化试剂，中国医药集团上海化学试剂公司)和胎牛血清(生化试剂， 中国医药集团上海化学试剂公司)。 淋巴细胞分离液：比重1，0774-0．001的聚蔗糖-泛影葡胺。 PBS缓冲液：分别称取NaCI(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)8．009，KCI(分析纯， 中国医药集团化学试剂有限公司)0．209，Na2HP04(分析纯，上海精化科技研究所)1．159， KH2P04(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)0．029，加蒸馏水定容至1000rrd。 冰醋酸(分析纯，苏州市振亚化工厂)，加蒸馏水按体积比配成2％的溶液。 2．3仪器设备 真空冷冻干燥机(上海东富龙科技有限公司)。 光学显微镜(MoticAE31)，麦克奥迪实业集团有限公司。 流式细胞仪(FACStar)，中科院上海细胞所流式细胞仪室。 2．4实验方法 1)细胞悬液配制实验使用的冻干容器是容量为2．5ml的安瓿瓶，每瓶中加入iml全 血细胞悬液