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基于液质联用技术解析和降低螺旋霉素发酵杂质 * 李友元 陈长华 顾熠峰 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237 摘要 利用LC-MS 联用技术定性分析了四种螺旋霉素发酵杂质 结果表明 它们都起因于螺旋霉素糖基化过程的紊 乱 氮源和铵盐对螺旋霉素生物合成糖基化过程有重要的调节作用 氮源优化使螺旋霉素发酵杂质含量显著降低22 -88 关键词 液质联用; 螺旋霉素; 杂质 优化 抗生素的生物合成属于产生菌的次级代谢 与初级代谢相比 具有生物合成途径复杂 生物合成 酶的基质特异性不高及调控机制不严密等特点 在产生菌的发酵液中 存在结构相近但生物活性相差 很大的多种组分 有些活性较小组分的存在严重影响抗生素的质量 因此获得生物活性高 毒性小的 有效组分 对提高抗生素质量至关重要 1 另一方面 抗生素等原料药的出口受到各国药典越来越严 格的质量要求 2001版欧洲药典规定 螺旋霉素原料药的成品主成份不能低于85%各杂质不能高于 2%现存螺旋霉素生产工艺中 发酵液中的4 种杂质在后处理中无法用常规分离手段去除 且含量高 于2% 电喷雾离子化 ESI 及其色谱-质谱联用 LC-MS 大大拓展了经典质谱法的应用范围 可有效 [2] 的分析复杂混合物中的单个或多个组分 国内外亦有利用 LC-MS 联用技术分析发酵液中多组分的 报道[ ] 本论文旨在利用 LC-MS 分析螺旋霉素发酵液中4 种杂质的结构 并指导工艺优化以降低 其含量 1 实验方法 1.1 材料和试剂 生二素链霉菌 Streptomyces spiramyceticus SPM1- 175 由河南天方药业有限公司提供 1.2 液质联用仪器及条件 流动相配比见表 其他条件同文献 表 1 流动相配比梯度程序 t/min ?(solve A)/% ?(solve B)/% 0 85 15 10 40 60 14 85 15 1.3 实验方法 1.3.1 样品预处理和杂质定性分析 取螺旋霉素罐发酵48 h 的发酵液30 mL 过滤,将滤液冷冻保存备 用 分析时取1 mL 滤液以10000 r/min 离心10 min 上清液用0.22 m 的膜过滤后置于进样瓶中待分 析 1.3.2 螺旋霉素发酵液主要杂质定性分析 为了节约时间 提高样品回收率并保证分析的准确性 实 验采取直接进样法 用上述HPLC 条件分离处理后, 取螺旋霉素罐发酵48h 的发酵液 色谱柱后流出 物依次经紫外和质谱串联检测 由总离子流提取得到质谱数据 根据各中间代谢物的分子式进行定性 分析 螺旋霉素发酵液HPLC 图谱和总离子图分别如图 和图 所示 图 中IM1 IM2 IM3 和IM4 代表在后处理中不能消除的杂质 IM1 IM2 IM3 IM4 图 螺旋霉素发酵液HPLC 图谱 图 螺旋霉素发酵液液质联用总离子图 2. 实验结果 2.1 螺旋霉素发酵杂质质谱 图 由于ESI 是一种高效的 软 离子化方式 可以得到高丰度的准分子离子峰 从质谱总离子流 中提取得到4 种杂质的质谱数据 如图3 所示 IM1 IM2 IM1 杂质IM1质谱图 I