法医物证学双语教学实验指导（2013年）.doc

法医物证学双语教学实验指导目录 （2013年1月） 酚-氯仿法(DNA extraction with phenol and chloroform) Chelex-100法（Chelex method） PCR扩增 (PCR amplification) 琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophorsis of DNA） 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis) 银染显色(Silver staining) 血痕联苯胺试验（Benzidine test for blood） 血痕无色孔雀绿试验（Leucomalachite green test） 血色原结晶试验(Blood tests of the original crystalline) 抗P30胶体金试验（The principle and method of p30 card） 骨DNA提取方法（DNA Extraction from Bone Fragments） 实验一 酚、氯仿法（有机法）提取DNA (DNA extraction with phenol and chloroform) 血液(痕)(Bloodstains) 取血液100μl(血痕0.5cm2)置1.5ml Eppendorf管中，加入400μl TES(10mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)，10%SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，37℃水浴过液，以等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次，氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L NaCl沉淀DNA，置-20℃ 2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，70%-75%乙醇洗涤10000rpm 5min，弃乙醇，DNA干燥后加适量ddH2O（pH 8.2）溶解备用。 组织(Tissue) 取10mg左右组织，研磨后，置1.5ml Eppendorf管中，加入400μl TES，10% SDS 40μl，10mg/ml PK12μl，后继步骤同1。 毛根(Hair root) 取4-6根带毛囊毛发（0.3cm），置0.5ml Eppendorf管中，加入100μl TES，10% SDS 10μl，10mg/ml PK8μl，39mmol/L DTT 10μl，后继步骤同1。 唾液斑(Saliva stain) 取唾液斑1.0-2.0cm2，剪碎，TES浸泡1h，用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体，去载体，10000rpm离心10min，弃上清，于沉淀内加入400μl TES，10% SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，37℃过夜或56℃两小时，后继步骤同1。 混合斑(Mixed stain) 取混合斑0.5cm2，剪碎，TES4℃浸泡2h，去载体，10000rpm离心10mm，弃上清液，于沉淀内加入400μl TES，10% SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，52℃3h，用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞，方法①再加入400μl TES，10%SDS40μl，10mg/ml PK15μl，39mm DTT40μl，37℃过夜或56℃2小时，以等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次，氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L NaCl沉淀DNA，置-20℃ 2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇(Ethanol)，DNA干燥后加适量ddH2O（pH 8.2）溶解备用；方法②加入5%Chelex-100 100μl，10mg/ml PK10μl，39mm DTT20μl，37℃过夜或56℃2小时，剧烈振荡，100℃加热10min，剧烈振荡，10000r-min 10min，取上清液进行检测扩增(Amplification)。 骨、指甲(Bone, nails) 同血液DNA提取，骨和指甲的消化时间延长至3天到1周，蛋白酶K(Protease K)用量为25μl（20mg/ml）左右，消化时加入适量39mM DTT。 The principle of Phenol-chloroform method The extraction of nucleic acids involves adding an equal volume of phenol-chloroform to an aqueous solution of lysed cells or homogenized tissue, mixing the two phases, a