牛β—乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达.pdfVIP

17卷 2期 生 物 工 程 学 报 l7 No 2 2001年3 Chinese J。… z tIf Biot~km)logy March 2001 牛 {L球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂 在小鼠乳腺中的表达 陈红星 程 萱 扬 晓 邓继先 苏国富 黄培堂 (军事医学科学院生物 ll程研究所，北京100071) 摘 要 用全长8 4kb的牛 乳球蛋白基因(RI G)作为调控序列 用 1 6kb的鸡溶苗酶 MAR序列作为对抗转基 因中位点效应的工具，构建了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射，经PCR和 S。u Lh rn瑚。t枪测，在 1 70只出生小鼠中获碍9只整合有牛BLG-tPA融台基因的转基因小鼠．并在转基因小鼠乳 汁巾榆测到tPA的括性，tPA的表达水平最高达到12~g／mL 整台在小鼠基因组中的牛BLG．tPA融合基因能稳定 地遗传给子代 关键词 牛 乳球蛋白基因 转基因小鼠 组织型纤溶酶原激活剂 中图分类号 Q789 文献标识码 A 文章编号1000—3061(2001 J02 0135．05 l985年LovelI—badge首次提出用转基因动物乳 列，与 5个牛BLG片段及tPA cDNA拼成牛BLG 腺生产重组蛋白质．短短几年，先后有利用酪蛋白、 tPA表达载体并建立了相应的转基因小鼠系，转基 乳球蛋白、乳清蛋白、乳清酸蛋白调控序列指导外源 因小鼠乳汁中tPA的表达量最高达到12tLg／mL，为 基因在乳腺中表达并获得分泌的报道_l-4。所有 今后建立大型动物乳腺生物反应器奠定了基础。 这些研究令人信服地表明r乳腺特异表达的转基因 1 材料与方法 动物作为生物反应器的可行性 用转基因动物乳腺 生产重组蛋白具有产量高、费用低的特点，并且对表 1．1 试剂与仪器 达产物具有翻译后修饰和加工能力。人组织型纤溶 Vent DNA聚合酶、T．Vector kit、限制酶、DNA 酶原激活剂对纤维蛋白有较强亲和力，可选择性溶 clean-up kit为promega公司产品。M2、MI6、石蜡 解血栓而不引起全身出血现象，是一种理想的溶血 油为Sigma公司产品 Taq DNA聚合酶、凝血酶、 栓药物，但它在血浆中的半衰期短，因而临床用量高 纤维蛋白原为华美公司产品。拉针仪、显微注射仪 达80mg／J~份。使用体外细胞表达系统难以达到中 为Nikon公司产品。菌株 JM109为 promega公司 试规模，因此，我们建立乳腺定位表达tPA的转基 产品。昆明白小鼠由本院丰台动物中心提供。 因小鼠模型，探索用转基因动物乳腺生产tPA的可 1．2 实验方法 能性。制备乳腺生物反应器的前提是要有合适的调 1．2．1 牛BLG基因及鸡溶菌酶MAR序列的PCR 控成分，研究证明乳蛋白基因的5 侧翼区、3 侧翼 扩增：根据 Gen—Bank中发表的牛BLG序列设计 5 区、内含子都对外源基因的表达有影响 I 牛BLG 对引物，分5段扩增，5对引物依次为： 是牛乳清中的主要蛋白质，为了获得它的表达调控 l：5 tgtcgaatggccgagctccctcc3 序列，本文克隆了8．4kb的全长牛 BLG基因，包括 5 tccctgcggtgttcaagatcgatgg3 1．8kb的5 侧翼区、4 7kb的基因组DNA区、1 7kb 2：5 aatgagggcctgggcgccacaag3 的3 侧翼医：为乳腺生物反