实验二减数分裂花粉母细胞制片及观察（4学时）一.ppt

* 实验二 减数分裂花粉母细胞制片及观察（4学时） 一、目的 1．学习和掌握细胞减数分裂染色体标本的制片技术和方法。 2．通过观察进一步熟悉减数分裂的全过程及各个时期染色体的动态变化和形态特征。 二 实验原理 减数分裂是发生在配子形成过程中一种特殊形式的有丝分裂，分裂过程中染色体结构也呈周期性变化，并在特定时期呈现稳定的形态特征，因而也是进行染色体形态、结构与数目鉴定的有利时期。减数分裂包含两次连续的有丝分裂——减数第一分裂和减数第二分裂；每次分裂都可分为紧密衔接的前、中、后、末四个时期，以前期Ⅰ变化最为复杂，又可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。通过减数分裂所形成的四分体细胞（或雌、雄配子），其染色体数目只有体细胞的一半。 减数分裂过程中染色体出现同源配对、非姊妹染色单体间片段交换、同源染色体相互分离等一系列独特行为，为远缘杂种的分析及三大遗传定律的论证等遗传研究提供了直接或间接的证据。 减数分裂细胞染色体制片取材以高等动、植物雄性生殖分裂较为方便。在适当的时机采集动物精巢或植物花蕾(花序)，经适当技术处理，压片就可在显微镜下观察到细胞的减数分裂过程。 三 实验材料 蚕豆(Vicia faba, 2n=2x=12)的幼嫩花蕾 四 实验器具、药品试剂 显微镜，计时器；染缸，酒精灯，培养皿，材料瓶，载玻片，盖玻片，镊子，解剖刀，解剖针，刀片，木夹，吸水纸，标签，铅笔等常用工具。 卡诺氏Ⅰ固定液，甘油蛋白，１mol/L HCI， 45％乙酸；0.5％醋酸洋红，无水乙醇，95％乙醇，80％乙醇，70％乙醇；石蜡。 五 实验方法 1．取材 获得处于适当减数分裂期的材料是制片成败的关键因素，而最适的时期又因实验主要目的不同而异。 田间取材的主要依据是植物外部形态指标，因此必需掌握各种植物减数分裂不同时期对应的外部形态指标。需要注意的是各种植物具体的外部指标，又依当年的温、水、光、肥等条件及植株的生长状况不同而异。 取材时间也不是固定不变的，主要看植物生长发育的最适温度而定。气温过低会影响减数分裂的正常进行，这时取材细胞常常处理前期、末期等时期，而终变期、后期、中期图像少；温度过高(30℃以上)时植株新陈代谢旺盛，减数分裂周期缩短，核质粘连严重，也不易获得理想的制片和观察效果。所以取材时植物的形态指标和时间必须十分恰当，才能获得理想的减数分裂图像。 8:00～10:00现蕾期，花蕾长约1 mm～2mm花蕾(蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内)。 2．固定 最常用的固定液是卡诺氏I液和II液。将取得幼嫩花序或花蕾立即投入固定液中，处理12～24h。倒去固定液，用梯度乙醇(95％-80％-70％)依次浸泡漂洗5～30min，直至去除乙酸味。固定后可置70％乙醇中保存，于4 ℃冰箱内可保存数年。幼小花药或临时检样时亦可不经专门固定处理，直接置于醋酸洋红中可同时达到固定和染色目的；但是先经过固定处理的材料更易于染色、分色和保存。 3．涂抹 用镊子直接从固定液或保存液中取出材料(花蕾、花序、幼穗等)，置吸水纸上除去固定液(保存液)；可用蒸馏水进行冲洗后再吸干，尤其是采用醋酸洋红染色法一定要将乙醇洗净。 用镊子、解剖针等工具取出一枚小孢子囊或花药置洁净载玻片上；用洁净的刀片或镊子压在小孢子囊或花药上向一端轻轻抹去，将花粉母细胞压挤出来，注意勿使花药太过破碎；将挤出花粉母细胞(呈半透明胶状)小范围内涂成薄层。 或将小孢子囊或花药置于载玻片，再于其上呈十字交叉方向盖一载玻片，用拇指紧压载玻片将花粉母细胞挤压出，并进行涂布。 4．染色 在涂好的载玻片上滴加一滴或半滴染液(视滴管大小而定，由于花粉母细胞在压片过程中特别容易随染液溢出，所以滴加染液宜少不宜多)，稍后用镊子把所有可见花药壁残渣清除干净，如果清除不彻底，压片过程中细胞和染色体不容易分散压平，片面不清洁，影响观察，而且制作永久片时会引起材料的大量脱落。 所用染液一般是醋酸洋红，有时为了促进染色可将载片在酒精灯上微烤轻微加热，但不可使染液煮沸。 5．初检与压片 染色后置于低倍显微镜下初步检查，若花粉母细胞正处于分裂期，即可覆盖盖玻片；然后以吸水纸包覆，用拇指垂直紧压，使细胞平整、染色体散开分布于同一平面，便于观察和记数；同时吸水纸可吸去盖玻片周围多余的染液。应注意勿使盖玻片发生搓动，以免破坏细胞与染色体的完整性。 6．镜检观察 在低倍镜下寻找适当视野，并正确区分处于减数分裂各个时期的花粉母细胞、二分体、四分体以及花粉粒