抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及初步应用.pdf

抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及初步应用 付少才‘陈万荣2刘树玲2 1北京京西动物医院2北京军事医学科学院微生物流行病研究所 目前，犬湿热(cD)还没有很好的治疗方法．但认为高效价免疫球蛋白在发病早期具有 较好疗效。为此，本研究制备了该病毒的单克隆抗体(McAb)，从建立的4株抗犬瘟热病毒 (CDV)McAh细胞株中，用微量细胞中和试验筛选得到了2株具有中和活性的特异抗CDVM— cAb细胞株，并应用于治疗中早期CDV感染犬。 l材料与方法 1．1材料BAI．B／e纯系小鼠。由中国医学科学院实验动物中心提供：SP2／0骨髓瘤细胞， 由军事医学科学院微生物流行病研究所提供：CDV10’I犬肾细胞培养渡、CDV细胞培养抗 原片，自制；细胞融合及杂交瘤筛选常用试剂．市购。 1．2动物免疫取10—1CDV细胞培养液0．5mL与O．5mL福氏完全佐剂混合，制成乳化 齐L第1次免疫给BAI．B／c小鼠皮下或肌肉注射化剂(0．2mL／只)。2周后用不完全福氏佐 剂第2次免疫，剂量、途径与第1次相同。2周后采血测定效价，效价达1：50001：10000以上 时供融合用。融合前3D加强免疫1次。 1。3抗CDVMcAb的制备取免疫BAI．B／c小鼠脾脏制备成脾细胞，以PEGl500为融合剂 与Str2／0骨髓瘤细胞进行融合，用免疫荧光抗体法检测融合杂交瘤分泌的McAh。用有限稀 释法克隆纯化阳性孔”i，对阳性孔克隆化3次，阳性率达100％的扩大培养．留上清，制备腹 水，以备鉴定。 1．4微量细胞培养中和试验按常规方法用犬肾细胞系(DK)细胞测定CDVⅡ∞帅，然后 利用固定病毒稀释血清法进行微量细胞培养中和试验。用I(DICIDso的病毒与等量不同稀 稀释度的腹水病毒混台物接种96孔DK单层细胞，每孔100ul，每个滴度加3孔，于37C、5％ OY2培养箱培养，逐日观察细胞病变(CPE)并记录。试验设维持液对照、单纯腹水对照和病 毒对照。根据CPE计算50％腹水中和终点，即能保护50％DK细胞不出现cPE的腹水稀释 度，按Reed—Mueneh方法计算McAb腹水的中和指数“，。 1．5中和交叉试验首先按常规方法用DK细胞测定CDV、犬细小病毒(CPV)的TCIDso， 交叉试验。 1．6治疗试验病犬100例，临床表现为体温升高(39．741c)多数病例表现为上呼吸道感 染症状，食欲减退，倦怠，眼鼻流水样分泌物，此后转变为粘液性浓性分泌物，随后出现支气 管炎、卡他性肺炎，严重时出现胃肠炎和神经系统症状。用ELISA检测粪便中的抗原呈阳 性，临床诊断为CDV感染。治疗时，将MeAN：l稀释，用O．2um的微孔滤膜过滤除菌，病犬 按0．5一一，1．OmL／kg于股内侧皮下注射或静脉滴注进行治疗。 172 2结果 2．ICDV杂交瘤细胞株的建立经过细胞融合，免疫荧光法筛选，将分泌MeAh阳性细胞 孔连续克隆3次，使抗体分泌阳性率达到100％，共获得4株能稳定分泌抗CDVMcAb杂交瘤 细胞，分别命名为A—l、A一2、A一3和A一4。经扩大培养后，分别制备抗CDVMeAb腹永， 利用间接免疫荧光法测定抗体效价，腹水和培养上清液效价见表1。 表1间接免疫荧光法测定抗体效价结果 2．2微量中和试验利用DK细胞测定CDVⅡ：Ⅲs。为5。5，DK单层细胞接种后分别在 72、96H出现，依次作为最终判断结果计算TcⅢ∞，正常细胞培养孔，细胞密集无间隙：病变 细胞圆缩、破碎，细胞间出现间隙。加MeAb腹水对照(稀释度l：8)对细胞有轻微的毒性作 用。经过3次中和试验测定MeAh的中和活性，获得2株MeAb(A一1、A一2)具有较好中和 A一4小于1：16。 2．3中和交叉试验A一1、h一2MeAh只中和CDV。而与CPV没有交叉反应。 射3次(间隔24h)后，病犬症状逐步减轻，食欲增加，精神状态变奸，l—2周内恢复健康，用 E啦～检测粪便中的抗原呈阴性。 3讨论 利用细胞融合技术制备了能稳定分泌抗CDV的杂交瘤细胞株，建立了免疫荧光细胞化 学染色抗原片快速鉴定MeAh建立了ELISA诊断CDV感染的方法。在此基础上，又通过微 MeAb的中和活性及其在中和反应中的特异性进行了鉴 量细胞培养中和交叉试验对抗CDV 定，筛选出了2gg-g有中和活性的MeAb细胞株。 目前对CDV感染的病犬还没有一种特异的治疗方