新城疫La+Sota毒株F基因重要功能区的克隆与序列分析.pdf

中国畜牧兽医学会生物制品学分会第十次学术研讨会论文集 新城疫LaSota毒株F基因重要功能区的克隆与序列分析+ 陈瑞爱，温纳相，裴仉福，唐满华，朱文冠，程含波，李琳 (广东大华农动物保健品有限公司，新兴527439) [摘要】为了从分子水平了解我公司生产新城疫灭活疫苗的基础种毒LaSota毒株，本研究应用RT—PCR技术获得了 La 明，插入片段与GenBank上登载的La 表明，虽然该毒株在我公司使用多年，但未发现任何突变或变异，属于弱毒株。 [关键词]新城疫病毒；F基因；基因克隆；序列分析 新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属的成员，为单 蛋白能介导病毒囊膜与宿主细胞膜或被感染细胞膜与正常细胞膜的融合过程，因此F蛋白是形成病毒毒力 的主要因素之一[1·2|。而决定NDV毒株毒力强弱的关键是前体蛋白Vo裂解位点的氨基酸组成‘3·4|。为了从 分子水平上了解我公司生产的新城疫灭活疫苗基础种毒LaSota毒株，我们对其F0裂解位点的基因结构进 行分析。 1材料与方法 1．1 毒株与试验动物LaSota毒株由本公司生物制品研究室提供；10日龄SPF鸡胚由北京梅里亚维通公 司提供。 Marker 1．2主要试剂限制性核酸内切酶Xba工和Hind DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、DNADL2000、 m、Taq 入一Hind111 KS digest为TaKaRa公司产品；RNA抽提试剂盒(TRIzol GelExtraction Plasmid Bio—tek 回收试剂盒(E．Z．N．A Kit)、质粒提取试剂盒(E．Z．N．AMiniprepKit)为Omega 公司产品。 18一T为TaKaRa公司产品，E．coliDH5a受体菌由本室保存。 1．3质粒载体和菌种pMD 1．4引物设计参考已发表的NDVF基因序列，设计一对引物P。和P2；引物由上海博亚生物技术有限公司 合成。 P1： 5’一GCAAGATGGGCTCCAGACC一3’ P2： 5’一CGGAGGATGTYGGCAGCAT一3’ 10min，一70C保存备用。 LS 1．6病毒RNA的提取按Invitrogen公司的RNA抽提试剂盒(TRIzolReagent)说明书操作，提取的RNA立 即进行RT—PCR反应。 1．7 片段的大小。 250r／min振摇过夜，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。 *作者简介：陈瑞爱(1970一)，女，广东省新兴县人，高级兽医师，硕士 一117— ofthe10th of AssociationofAnimal Branch,Chinese and ProceedingsSymposiumBiological Ve—te—rinaryScien—c—e 1．9序列测定经PCR及酶切鉴定为阳性的克隆 菌株，送上海博亚生物技术有限公司进行序列测定。 2 结果 2．1 目的基因片段的RT—PCR以基础种毒的基因 组RNA为模板，使用引物P1和P2可扩增出约500bp 的片段，与预期设计的扩增片段大小基本相符(见图 图1 RT—PCR产物的电泳结果 1)。 Fig．1 forPCR 2．2重组质粒的鉴定 目的基因片段与pMDl8一T