棉花体细胞胚胎发生过程的转录谱、细胞学及内源激素生化因子动态分析.pdfVIP

史国监垄堂盒!Q堂生生垒墅筮主达垡枣盔金迨塞垂塑 !!兰 棉花体细胞胚胎发生过程的转录谱、细胞学 及内源激素生化因子动态分析 of and Biochemical IntegratedAnalysisTranscriptomePp删崦，锄0109ical WholeSomatic ProcessinCotton 功，lljm血ActivityDu而喀the Embryogenesis 曾范昌。朱龙付。涂礼莉。刘迪秋，金双侠，张献龙 (华中农业大学植物科技学院，作物遗传改良国家重点实验室，国家植物研究中心， 湖北武汉430070) 摘要：棉花组织和细胞培养工作受到国内外广泛重视。体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis) reprogramming)过程，是植物发育过程中 是体细胞向胚胎发生途径转变的发育再建(developmental 的独特现象。体细胞胚胎发生现象被看作是开展生物学理论研究的良好模型。研究棉花体细胞胚胎 发生过程中基因表达的转录谱，鉴定并最终克隆体细胞胚胎发生相关的关键基因，分析该生物过程 的细胞学和内源生化目子动态变化，对阐明植物界体细胞胚发生和发育的机理，促进棉花的遗传工 程改良，在基础理论和实际应用价值上都有重要意义。 关键词：棉花；体细胞胚发生；转录谱；内源激素；流式细胞仪分析 为了分离参与体细胞胚胎发生早期起始过程有关的基因，采用SSH技术分离了在胚性愈伤和各 时期胚状体中差异表达的eDNA。这一技术所具有的平衡化和选择性PCR扩增来富集差异微弱的调 控及信号分子的优势，加上取材的细胞学鉴定技术，克服了胚性细胞和非胚性细胞在胚性分化早期 难以区分、取样困难等问题。经过两套差异筛选程序和反向Northernblot分析，最终分离鉴定获得了 明显地上升表达，这242个基因中囊括了以往植物界在本领域研究中分离的体细胞胚胎发生相关的 大部分基因。而且一半以上的基因以前没有报道其与体细胞胚胎发生有关。克隆获得了具代表性的 胚胎发生早期特异表达的eDNA库，实现了植物体胚发生重要基因资源的成功挖掘。尤其重要和感 兴趣的是我们分离鉴定了很多十分关键的启动体细胞胚胎早期发生和发育新程序的转录调控因子和 细胞信号转导开关基因。鉴定了脂质转移蛋白(LTP)这一体细胞胚性起始再分化(细胞全能性启 动)典型分子标记，这一类稳定的分子标记可在早期鉴定诊断细胞是否是胚性。多种代谢有关的基 因也参与了胚胎发生与发育。同时我们分离的大约1／3胚胎发生有关基因是在GenBank中不存在的 未知新基因。我们又通过cDNAarray技术完整地对体细胞胚胎发生差异表达的相关基因进行了其 胚性细胞分化前后及随后胚胎发育的典型时期(球前原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚)表达谱 分析，揭示了这一发育过程中存在的几类不同基因类群及其特异的表达模式(expressionpatterns)． 全面详尽地阐明了在细胞内完成这一独特的生物发育全过程中在转录组水平上所进行的基因特异调 (genegroup)在胚胎发育的不同时期特异表达模式。在细胞水平，应用流式细胞仪鉴定了分别代表 棉花体细胞脱分化、再分化的两次染色体解螺旋细胞学特征标记。同时，对体胚发生内源激素动态 测定表明，细胞内生长素IAA及生长索与分裂素比值的急剧增加是非胚性细胞向胚性转变的一个显 著的生化特征。本研究系统地对体细胞胚胎发生和发育这一复杂过程在不同水平迸行了鉴定和阐 述，也为合子胚胎发育研究提供了重要的理论基础和借鉴信息。该课题创建了一系列棉花体细胞脱 分化、再分化、同步化及体细胞胚胎发生离体操作系统及应用基础研究平台体系。为体细胞胚胎发生 乃至发育生物学研究中挖掘、分离、筛选、鉴定表达微量的调控和信号等关键基因提供了一套有效 的创新技术手段。提出细胞增殖分裂和凋亡衰老两个生物现象的平衡及互相制约程度是决定细胞是 否获得胚性进而启动分化的理论观点；从大规模eDNA阵列